L’ANTRACE: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Antonio Goglio Microbiologia e Virologia

1. L’ANTRACE: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Antonio Goglio Microbiologia e Virologia AO Ospedali Riuniti di Bergamo Antrace 4 - www.apsi.it

2. Diagnosi microbiologica • Il ruolo dei laboratori di microbiologia clinica consiste essenzialmente nell'effettuare una diagnosi presuntiva • Tutti i laboratori debbono essere in grado di sospettare la presenza di B. anthracis • Nel sospetto il campione e/o le colture devono essere inviate ad un laboratorio, che possegga aree di lavoro corrispondenti al terzo livello di contenimento (P3), per la diagnosi definitiva. Antrace 4 - www.apsi.it

3. B.anthracis • è aerobio e anaerobio facoltativo • immobile, sporigeno e, se ceppo virulento, capsulato • non-emolitico su agar sangue di montone • sensibile alla penicillina (salvo rarissimi ceppi, più spesso modificati) • può presentarsi in due diverse forme: • in forma vegetativa (1-1,5 x 3-8 m) • in forma di spora (1 m). Antrace 4 - www.apsi.it

4. B.anthracis: forma vegetativa • la forma vegetativa (fase di attiva moltiplicazione) è quella che si riscontra nelle lesioni cliniche, nei relativi campioni biologici e di conseguenza nelle colture microbiologiche • solo la forma vegetativa è in grado di produrre le tossine (antigene protettivo, fattore letale, fattore edemigeno) e la capsula , due dei fattori di virulenza • tale forma vegetativa è facilmente distrutta dai disinfettanti comunemente utilizzati in ospedale, in particolare da quelli a base di cloro Antrace 4 - www.apsi.it

5. B.anthracis: spore • la forma di spora (fase di quiescenza) è quella che il microorganismo acquista in situazione di svantaggio e gli consente la sopravvivenza (in presenza di ossigeno atmosferico, nella terra e nel suolo, in acqua, polveri, pellami, ….) • solo nel momento in cui si ritrova in un ambiente favorevole (inoculazione di spore attraverso lesioni cutanee, ingestione con acqua o alimenti, inalazione di un’elevata quantità di spore) riprende la capacità di moltiplicarsi e di dare danno • le spore sono particolarmente resistenti nell’ambiente (sopravvivono anni) e non sono distrutte dai comuni disinfettanti Antrace 4 - www.apsi.it

6. Biosicurezza (1) • B. anthracis non è contagioso da persona a persona • L'infezione cutanea avviene solo attraverso soluzioni di continuo della cute e la forma da inalazione necessita di una elevata carica di spore, per cui il rischio di trasmissione in laboratorio è praticamente nullo • Per i campioni potenzialmente infetti, adottare misure almeno del 2° livello di contenimento (cappa a flusso di classe 2 con filtri HEPA, indumenti di protezioni personale -camici monouso, guanti di lattice, mascherine, occhiali o schermi di protezione-) Antrace 4 - www.apsi.it

7. Biosicurezza (2) • Le procedure devono essere eseguite da microbiologi o tecnici di microbiologia esperti • Nel caso si giunga ad una identificazione presuntiva della presenza di B.anthracis, è sconsigliato allestire ulteriori procedure identificative. Il campione e/o la coltura devono essere inviati ad un laboratorio di riferimento per la diagnosi definitiva. Antrace 4 - www.apsi.it

8. Decontaminazione • Le superfici che possono essere state a contatto con materiali infetti devono essere decontaminate con prodotti a base di cloro in concentrazione di: • 5.000 ppm (es. ipoclorito di sodio 5,25% -la comune candeggina- diluito 1:10) * • 10.000 ppm (come sopra, diluendo 1:5) ** • Gli altri materiali devono essere autoclavati seguendo le procedure in vigore nel laboratorio per i materiali infetti • il CDC consiglia l’uso di diossido di cloro (gas) per il trattamento di ambienti contaminati da spore • CDC, Guidelines for State Health Dpt (14.10.01) • PHLS Provisional guidelines for action in the event of a deliberate release (11.10.01) Antrace 4 - www.apsi.it

9. Esame diretto dei campioni clinici • Allestire due vetrini con uno striscio del materiale in esame: fissarli per 1 minuto con etanolo assoluto oppure 10 min con metanolo • Colorare un vetrino con il Gram e uno con il Giemsa e osservarli al microsopio in immersione • La presenza al Gram di grossi bacilli Gram-positivi (1-1.5 X 2-8 mm), con estremità squadrate e in corte catene di 2-4 cellule suggerisce la presenza di B. anthracis • La colorazione di Giemsa può mettere in evidenza la presenza di capsula Antrace 4 - www.apsi.it

10. Gram di B. anthracis da sangue di scimmia (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf Antrace 4 - www.apsi.it

11. Gram di B. anthracis da agar sangue (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf Antrace 4 - www.apsi.it

12. Gram di B. anthracis con spore (1000x) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf Antrace 4 - www.apsi.it

13. Esame colturale (1) Tampone nasale • semina diretta su piastre di AS • utile anche semina dopo trattamento termico o con alcool per eliminare la flora commensale • stemperare il tampone in 1 ml circa di diluente (soluzione fisiologica o brodo) e sottoporre la sospensione a shock termico (bagnomaria a 65°C per 10 min.), oppure a shock etanolico (aggiungere pari volume di alcool etilico assoluto per 30 min.) • dopo trattamento possono essere seminate, per inondazione, una o più piastre di AS con 0,1 ml della sospensione. Antrace 4 - www.apsi.it

14. Esame colturale (2) Altri campioni • B.anthracis cresce rapidamente sui comuni terreni colturali, ma non su MacConkey • allestire una coltura su Agar Sangue di montone (AS): su questo terreno è possibile evidenziare alcune caratteristiche distintive di B.anthracis • allestire in contemporanea colture su altri tipi di terreni, secondo le procedure in uso nel laboratorio per i diversi tipi di campioni clinici • incubare a 35°-37° C in un termostato ad aria per 18-24 ore Antrace 4 - www.apsi.it

15. Caratteristiche colturali (1) Aspetto delle colonie (su AS dopo 15-24 ore a 35-37°C) • colonie di 2-5 mm, biancastre, a vetro smerigliato, rotonde o irregolari, piane o leggermente convesse, con margini frastagliati e proiezioni a forma di virgola che protrudono dal bordo della colonia (aspetto a “caput Medusae”) • non emolitiche, a differenza di quelle di altre specie, quali B. cereus e B. thuringiensis, che producono su AS beta emolisi (emolisi completa) • con consistenza notevole, appiccicose e filanti, quando raccolte con un'ansa Antrace 4 - www.apsi.it

16. Caratteristiche colturali (2) Aspetto delle colonie (su Agar cioccolato dopo 15-24 ore a 35-37°C) • mucose, se il ceppo è capsulato • la capsula si forma in presenza di CO2, o in terreni contenenti bicarbonato di sodio 0,7% Antrace 4 - www.apsi.it

17. Caratteristiche colturali (3) • La rapidità di crescita (12-15 ore ) di B. anthracis può essere sfruttata per isolare il microrganismo da una coltura mista • Al Gram i batteri cresciuti su AS in aria: • non presentano capsula • appaionocome lunghe catene di bacilli Gram-positivi • contengono spore, più o meno numerose, centrali o subterminali, ovali, che non dilatano il corpo batterico. Antrace 4 - www.apsi.it

18. Morfologia delle colonie di B. anthracis (da agar sangue, dopo 18-24 ore) www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf Antrace 4 - www.apsi.it

19. Colonie “appiccicose” di B. anthracis, da agar sangue www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf Antrace 4 - www.apsi.it

20. Test addizionali Antrace 4 - www.apsi.it

21. B. cereus (destra) e B. anthracis (snistra), su agar sangue, dopo 24 ore www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf Antrace 4 - www.apsi.it

22. Fonti bibliografiche • ISS (www.iss.it) • JAMA, 1999, Consensus statement • N Engl J Med, 1999, Dixon e al. • CDC (www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf) • PHLS (www.phls.co.uk/advice/anthrax_guidelines.pdf) • links: www.apsi.it Antrace 4 - www.apsi.it