Aminoácidos, peptídeos e proteínas

1. Aminoácidos, peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

2. Características químicas dos aminoácidos Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

3. Os aminoácidos • Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L • A biologia é canhota • Glicina nãotem isomeriaóptica Carbono alfa

4. Grupo R apolar e alifáticos • Aminoácidos apolares e hidrofóbicos • Ligações de Van der Waals • Ala, Val, Leu, Iso • Interações hidrofóbicas • Gly; menor aminoácido • Met • Possui átomo de enxofre • Pro • Iminoácido, menor flexibilidade estrutural

5. Grupo R aromáticos • Aminoácidos hidrofóbicos • Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água • Modificações pós-traducionais • Fosforilação do OHda tirosina • Fenilalanina • Mais apolar

6. Grupos R polares, não carregados • Solubilidade intermediária em água • Serina e treonina • Grupos hidroxil • Asparagina e glutamina • Grupo amida • Cisteína • Grupo sulfidril • Ligações dissulfeto

7. Grupos R carregados • Aminoácidos básicos • Carga positiva • Lisina, segundo grupo amino • Arginina, grupo guanidina • Histidina, grupo aromático imidazol • Aminoácidos ácidos • Carga negativa • Possuem segundo grupoácido carboxílico

8. Aminoácidos incomuns • Modificações pós-traducionais • 4-hidroxiprolina • 5-hidroxilisina • 6-N-metil-lisina • Gama-carboxiglutamato • Fosforilação de resíduos • Selenocisteína • Selênio ao invés de enxofre na Cys • É adicionado durante a tradução pormecanismo específico e regulado

9. pH e pKa • Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas • Ionização • < pH; > [H]+estado não-ionizado

10. Aminoácidos são ionizáveis • Substâncias anfóteras: possuem natureza dual • Podem funcionar assim como ácidos ou bases • Doam ou recebem prótons

11. Titulação de um aminoácidos • pKa: tendência de um grupo fornecer um próton ao meio • Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio • Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas

12. Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos • Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral

13. Peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

14. Polipeptídeo >Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

15. Peptídeos tbm são ionizáveis • Ou seja, possuem curva de titulação característica • Funcionam em faixas de pH ótimas

16. Número de resíduos por proteína

17. Uso de aminoácidos • Varia bastante entre as proteínas • Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula

18. Proteínas com outros grupos químicos • Adicionados pós-traducionalmente

19. Trabalhando com proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

20. Proteínas podem ser separadas e purificadas • Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas? • Basta selecionar por propriedade • Tamanho, carga e propriedades de ligação • Obter o extrato bruto • “correr” em cromatografia de coluna • Fase estável (matriz) • Fase móvel (solução com tampão) • Coluna maior permite maior resolução na separação

21. Cromatografia por troca iônica • Polímero carregado negativamente • Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna • Afinidade da proteína é definido também pelo pH

22. Cromatografia por exclusão de tamanho • Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores • Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro

23. Cromatografia de afinidade • Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse • Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz • Elui-se com solução de ATP

24. Eletroforese -- Histórico • 1952, Markham and Smith • Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico • 1955, Smithies • Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano • 1967, Loening • Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA • 1980, Schwartz and Cantor • Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes • É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante... Vou ali correr um gelzinho e já volto Tenho que ir senão vou perder meu gel

25. Eletroforese • Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme • DNA, carga negativa • Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico • Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica • Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) • Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular

26. Eletroforese, etapas • Preparação do gel • Aplicação das amostras • Eletroforese • Coloração • Análise dos resultados

27. Preparação do gel Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida

28. Aplicação das amostras Definição do mapa das amostras por canaleta

29. Corrida do gel • Aplicação do campo elétrico • Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão • Terminais positivo e negativo • Tempo adequado, senão o DNA sai do gel

30. Coloração das moléculas • Prata • Gel SDS-PAGE • PoliAcrilamide Gel Electrophoresis • Melhor resolução • Coomassie blue, etc • Brometo de etídio • Agente intercalante do DNA • Cancerígeno! • Composto fluorescente à luz UV • Gel de agarose

32. Eletroforese de um resultado de cromatografia

33. O marcador de peso molecular • Comprado de uma empresa • Possui proteínas de peso molecular bem conhecido • Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra

34. Geis bidimensionais • Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira-se-o e corre-se em outra dimensão • Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra • Maiores géis dão maiores resolução

35. Proteínas não separadas podem ser quantificadas • Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa • Deve-se poder medir o produto da ação enzimática • Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC

36. Estrutura primária das proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

37. Níveis estruturais das proteínas

38. As estruturas primárias das proteínas são conhecidas • Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo • As pontes dissulfetopodem se formar entre diferentes cadeias protéicas • E principalmente dentro da mesma

39. Sequenciamento de peptídeos • Degradação de Edman • Marca e remove apenas o resíduo N-terminal • Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas • Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina

40. Produção de peptídeos • Purificação a partir de tecidos • Engenharia genética • Síntese química direta

41. Alinhamento de sequências • Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas) • Derivam do ancestral comum entre os organismos • O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína

42. Evolução molecular • Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente

43. Árvore molecular da vida

44. Conclusões • Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas • Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenasou milhares para formar peptídeos e proteínas • As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente • As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese • As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida) • As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra