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12. Arbeitstagung Martinsried 18.-20. Juli 2005

12. Arbeitstagung Martinsried 18.-20. Juli 2005. Contest Proteomanalyse von 10.000 Zellen. Analyse eines Zellpellets aus 10.000 Zellen. Zellen wurden gezählt und mit PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10.000 Zellen pro 10 µ l eingestellt.

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12. Arbeitstagung Martinsried 18.-20. Juli 2005

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  1. 12. Arbeitstagung Martinsried 18.-20. Juli 2005 Contest Proteomanalyse von 10.000 Zellen

  2. Analyse eines Zellpellets aus 10.000 Zellen Zellen wurden gezählt und mit PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10.000 Zellen pro 10 µl eingestellt. Zellen wurden aliquotiert und in der SpeedVac eingeengt. • Menschliche Zellinie aus embryonalen Nierengewebe • HEK 293 Zellen wurden unter Standardbedingungen kultiviert. • Zellen wurden bei 4°C geerntet und 3 mal mit PBS-Puffer gewaschen

  3. Reproduzierbarkeit der Aliquotierung der Pellets von 10.000 Zellen 1 2 3 4 5 6 7 • Reproduzierbarkeit der Erzeugung der Zellpellets wurde mittels SDS-PAGE überprüft 1 Marker 2-7 Pellets von 10.000 Zellen

  4. Optimierung der Verdaubedingungen Bedingungen: A B C D E • Für die Optimierung des Verdaus wurden verschiedene Bedingungen getestet • Ansätze wurden mittels SDS-PAGE verglichen - + - + - + - + - + Marker A Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall/Benzonase -/+ Trypsin B Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall -/+Trypsin C Phosphat-Puffer /CHAPS/95°C/Benzonase -/+ Trypsin D Phosphat-Puffer/CHAPS/ 95° -/+Trypsin E 1 M Harnstoff-Puffer/CHAPS -/+ Trypsin

  5. Herstellung des Verdaus von10.000 Zellen • Ausgangsmaterial: Zellpellet aus 2 Millionen Zellen • In 20 µl Lysis-Puffer (TrisHCl 30 mM; Thioharnstoff 2M; Harnstoff 7 M; CHAPS 4 %) aufgenommen • 6 x 10 Sekunden Ultraschall lysiert • 1:10 verdünnt mit 10 mM NH4HCO3-Puffer • 100 µl Trypsinlösung (0,06 µg/µl) zugegeben • Inkubation über Nacht • Volumen auf 2 ml gebracht (Wasser) • In 10 µl Aliquots aufgeteilt; entsprechend 10.000 Zellen • Aliquots in der SpeedVac eingeengt

  6. Reproduzierbarkeit der einzelnen Contest-Aliquots Basepeak-Chromatogramme von vier Contest-Verdau Proben LCQ classic Säule: C18; Ø 75 µm x 25 cm Gradient Ameisensäure, 90 min

  7. 2D-PAGE von 10.000 Zellen, 2 µg Protein, Cy3-markiert (40 cm x 30 cm) 3.100 Proteinspots

  8. Contest-Teilnehmer

  9. 52 +64 +110 +171 +251 1109 Übereinstimmung (Homologiecluster) der identifizierten Proteine zwischen den Contest-Teilnehmer Insgesamt 1757 nicht-homologe Sequenzen Nature Methods Vol. 2,9, Sept. 2005, 647-48

  10. How to deal with data & results performing high-throughput proteomics • Experiments – irrespective of their size and effort and of the amount of the acquired data - have to be repeated independently several times to demonstrate their reproducibilty to get significant results • This will remove most of the „1hit wonders“ • One-time experiments can not elucidate quantitative differences in two different proteomes, therefore, they should not be named quantitative! • We have to go back to scientifically sound experimental work & strategies to create value(s) for ourself and for the society who gives us the money and deserves that we do our best.

  11. Danksagung Anja Tatzel - Biochemiestudentin Christian Stephan - Bioinformatik Christian Scheer –Protagen, Bioinformatik Christian Bunse – LC-MS/MS Oliver von End – Nierenzellen Kai Stühler

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