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Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari

Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari. IL RUOLO DI UNA FAMIGLIA DI MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS THALIANA NELLO SVILUPPO. Mario Larosa a.a. 2013/2014.

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  1. Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari IL RUOLO DI UNA FAMIGLIA DI MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS THALIANA NELLO SVILUPPO Mario Larosa a.a. 2013/2014

  2. LA TRASDUZIONE DEL SEGNALE MEDIATA DALLA CASCATA DELLE CHINASI ATTIVATE DA MITOGENO (MAPK) È UN MECCANISMO ALTAMENTE CONSERVATO NEGLI EUCARIOTI Stimolo MAPKKK Nel genoma di Arabidopsis 80 MAPKKK MAPKK 10 MAPKK MAPK 20 MAPK Crescita e Sviluppo Immunità

  3. LE MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS (Adattata da Champion et al., 2004)

  4. LA FAMIGLIA DELLE “ARABIDOPSIS NPK1-RELATED PROTEIN KINASE” (ANP) La famiglia genica ANP è costituita da tre membri: ANP1, ANP2 ed ANP3 • Sono stati identificati per la loro omologia conNUCLEUS– AND PHRAGMOPLAST-ASSOCIATED PROTEIN KINASE1 (NPK1) di tabacco • Sono ridondanti funzionalmente: singoli mutanti knockout (KO) non differiscono dal WT, mentre solo il doppio KO anp2 anp3 mostra evidenti difetti nello sviluppo e nella citochinesi Il triplo mutante KO è letale: le ANP sono COLLETTIVAMENTE ESSENZIALI nello sviluppo della pianta (Adattata da Krysan et al., 2002)

  5. TRIPLI MUTANTI CONDIZIONALI anp DMSO β-estradiolo (µM) Silenziamento genico mediato da microRNA artificiali (amiR) inducibili da β-estradiolo 0.05 1 5 10 Wt pri-amiRANP1 espresso nel doppio KO anp2 anp3 amiR1 (fenotipo alterato nello sviluppo) DMSO β-estradiolo (nM) 2.5 5 10 20 pri-amiRANP3 espresso nel doppio KO anp1 anp2 amiR3 (fenotipo normale)

  6. LA PARETE CELLULARE VEGETALE Componenti microfibrillari Cellulosa La parete primaria è costituita da: Emicellulose Componenti matriciali Pectine (Adattata da Malinovsky et al., 2014b)

  7. STRESS BIOTICI E ABIOTICI POSSONO ALTERARE L’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN ARABIDOPSIS THALIANA Un danno alla parete cellulare (Cell Wall Damage, CWD) può essere causato da: Enzimi litici rilasciati da un patogeno durante l’infezione Stress fisici (Adattata da Szymanski e Cosgrove, 2014) (Adattata da Bellincampi et al., 2014) Agenti chimici

  8. IL MECCANISMO DI MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE La cascata delle MAPK media la segnalazione attivata dalla percezione del danno alla parete nel lievito (Adattata da Levin, 2011)

  9. OBIETTIVO DELLA TESI Caratterizzazione del ruolo delle ANP nello sviluppo della radicee nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare di Arabidopsis thaliana

  10. LA MANCANZA DELLE ANP PROVOCA L’ESPANSIONE CELLULARE RADIALE NELLA RADICE Wt 1 μM β amiR3 DMSO amiR3 20 nM β amiR1 1 µM β Plantule di sette giorni

  11. Wt 20 nM IXB amiR3 1 μM β LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI RISULTANO SIMILI A QUELLE DI PLANTULE WT TRATTATE CON L’ERBICIDA ISOXABEN (IXB) Plantule di sette giorni

  12. L’ISOXABEN È UN AGENTE MODELLO PER LO STUDIO DEL DANNO ALLA PARETE CELLULARE VEGETALE (N-[3-(1-Etil-1-metilpropil)-5-isoxazolil]-2,6-dimetossibenzamide) (Adattata da De Bolt, 2007) E’ un potente inibitore della biosintesi di cellulosa L’IXB induce il danno alla parete cellulare vegetale Differenti Cellulosa Sintasi A (CESA) sono bersagli dell’azione dell’IXB (Paredez et al., 2006) Piante trattate con IXB presentano un minore contenuto di cellulosa (Bischoff et al., 2009)

  13. ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN WtWt β-estradiolo (1 μM)Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM)amiR3 β-estradiolo (1 μM) Radici di plantule di dodici giorni Alcohol-Insoluble Solid (AIS) Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi degli zuccheri totali AIS de-amilato Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi Cellulosa cristallina Analisi Pectine Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi emicellulose

  14. 1400 1200 * * * 1000 800 g Zuccheri totali/mg AIS de-amilato 600 400 200 0 β + - - + - + IXB - + - - - - Wt amiR3 amiR1 LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO ZUCCHERI TOTALI

  15. ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN WtWt β-estradiolo (1 μM)Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM)amiR3 β-estradiolo (1 μM) Radici di plantule di dodici giorni Alcohol-Insoluble Solid (AIS) Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi degli zuccheri totali AIS de-amilato Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi Cellulosa cristallina Analisi Pectine Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi emicellulose

  16. 14 12 10 * Cellulosa cristallina (g glucosio mg-1 AIS de-amilato) 8 * ** 6 4 2 0 - + - - + - + β - - - - - - + IXB Wt amiR1 amiR3 LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO CELLULOSA CRISTALLINA RISPETTO AL WT

  17. ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN WtWt β-estradiolo (1 μM)Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM)amiR3 β-estradiolo (1 μM) Radici di plantule di dodici giorni Alcohol-Insoluble Solid (AIS) Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi degli zuccheri totali AIS de-amilato Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi Cellulosa cristallina Analisi Pectine Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi emicellulose

  18. 0.12 0.1 * * * 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 * 0.05 * * 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0.12 0.1 0.08 LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB,CONTENGONO MENO PECTINE MA POSSIEDONO PIÙ EMICELLULOSE ESTRAIBILI CON KOH 0.1 M RISPETTO AL WT 0.06 0.04 0.02 0 Frazione emicellulosica Frazione pectica g Zuccheri ChASS/zuccheri totali g Zuccheri 0.1M KOH/zuccheri totali g Zuccheri 4M KOH/ zuccheri totali β + - - + - - + + - - + - + + - - + - + IXB - + - - - - - + - - - - - + - - - - Wt amiR1 amiR3 Wt amiR1 amiR3 Wt amiR1 amiR3 Nella frazione emicellulosica estratta con KOH 4 M non ci sono differenze significative

  19. IXB Cell Wall Damage Acido jasmonico ROS Lignina LA SINDROME DA DANNO ALLA PARETE CELLULARE (CELL WALL DAMAGE SYNDROME - CWDS) IN ARABIDOPSIS La percezione del danno alla parete porta ad una serie di risposte come l’aumento di specie reattive dell’ossigeno (ROS), la deposizione ectopica di lignina e l’accumulo del fitormone acido jasmonico. (Adattate da Denness et al., 2011)

  20. DMSO 10 nM β 20 nM IXB Wt amiR3 I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UN MAGGIORE ACCUMULO DI ROS EXTRACELLULARE ED UNA DEPOSIZIONE ECTOPICA DI LIGNINA 0.09 0.08 0.07 0.06 nmolH202/mg peso fresco /ml 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 - + - + - + 1 µM β 10 nM β amiR1 amiR3 Wt

  21. I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UNA MAGGIOR ESPRESSIONE BASALE DEI GENI REGOLATI POSITIVAMENTE DALL’ACIDO JASMONICO ERF1 THI2.1 PDF1.2 18 1.6 2 16 1.4 14 1.2 1.5 12 1 10 1 0.8 8 0.6 6 0.4 0.5 4 0.2 2 0 0 0 Unità Arbitrarie (x10-3) - + - + - + - + - + - + 10 nM β Wt amiR3 Wt amiR3 Wt amiR3

  22. LA FAMIGLIA GENICA ANP È RICHIESTA PER IL MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ STRUTTURALE DELLA PARETE IN ARABIDOPSIS ANP Cellulosa cristallina Pectine Emicellulose Alterazione nella composizione della parete cellulare CWDS ROS JA Lignina nella radice

  23. TALI ALTERAZIONI SONO MOLTO SIMILI AL TRATTAMENTO DEL WT CON L’ERBICIDA ISOXABEN IXB Cellulosa cristallina Pectine Emicellulose Alterazione nella composizione della parete cellulare CWDS ROS JA Lignina nella radice

  24. 45 40 35 30 % inibizione dell’allungamento della radice 25 20 15 10 5 0 ANP1SE ANP3SE Wt LE ANP SONO IMPLICATE NELLA RISPOSTA ALL’ISOXABEN 70 * 60 * 50 * 40 % inibizione dell’allungamento della radice * * 30 20 10 0 Wt anp1 anp2 anp1 anp3 anp2 anp3 I doppi mutanti mostrano una minore sensibilità all’IXB al contrario dei mutanti sovraesprimenti le ANP, che risultano maggiormente sensibili all’erbicida

  25. CONCLUSIONI • La famigliagenicaANP è richiesta per ilmantenimentodell’integritàstrutturaledellaparete in Arabidopsis • I tripli mutanti anp, al pari delle piante WT trattate con IXB, mostrano la sindrome da danno alla parete • Le ANP sono richieste per la risposta al trattamento con l’IXB Le ANP sono le prime MAPKKK note per esser coinvolte nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare vegetale

  26. PROSPETTIVE Tra i futuri obiettivi dello studio di questa famiglia genica figurano: Caratterizzazione della localizzazione subcellulare Identificazione dei loro diretti interattori

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