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Régulation par les petits ARN eucaryotes et procaryotes

Régulation par les petits ARN eucaryotes et procaryotes. Daniel Gautheret. ARN régulateurs eucaryotes. L’interférence ARN. Comment ça marche?. Début années 90: ARN antisens Effets modestes et parfois incohérents. Article de Fire & Mello 1998.

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Régulation par les petits ARN eucaryotes et procaryotes

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Presentation Transcript

  1. Régulation par les petits ARN eucaryotes et procaryotes Daniel Gautheret

  2. ARN régulateurs eucaryotes

  3. L’interférence ARN

  4. Comment ça marche? • Début années 90: ARN antisens • Effets modestes et parfois incohérents

  5. Article de Fire & Mello 1998 The unc-22 gene encodes a myofilament protein. Decrease in unc-22 activity is known to produce severe twitching movements (convulsions). Injected double-stranded RNA, but not single-stranded RNA, induced the twitching phenotype in the progeny. Image: Bertil Daneholt. http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html

  6. Observations importantes • Le silencing ne fonctionne qu’avec une séquence de cet ARNm • La séquence doit provenir d’ARN mature • Après transcription / cytoplasmique • L’ARNm ciblé semble être dégradé • Quelques molécules d’ADNds suffisent • Soit amplification, soit catalyse • L’effet peut se transmettre entre tissus, voire à la descendance • Transmission

  7. 1999: le mécanisme • Présence de petits ARN de 20-25nt contenant les deux brins: les siRNA (small interfering) • Ces ARN sont produits par clivage de l’ARNds • Ce sont les petits ARN qui interagissent avec l’ARNm

  8. 2000: découverte de la machinerie • Dicer: Rnase III • Coupe un segment double-brin de 21-25nt • Asymetrique: bouts libres de 2nt • RISC: RNA-induced Silencing Complex • Un des deux brin (celui avec bout 3’ libre) est sélectivement incorporé dans RISC • RISC dirige le clivage du mRNA complémentaire Image: Bertil Daneholt. http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html

  9. Importance de la découverte • Protection contre les virus • La mutation de RISC compromet la resistance des pantes aux virus • Un nouvel outil pour réprimer spécifiquement les gènes • Répression de la synthèse protéique • Régulation du développement • Des siRNA naturels: les miRNAs

  10. 1993: découverte du premier microRNA (Laboratoire de Victor Ambros) • 4 stades larvaires: L1 à L4 • Ambros isole un mutant qui « réitère » le stade L1 • Ce mutant présente une délétion du gène lin-4 • Lorsqu’on insère dans un animal transgénique un fragment d’ADN contenant le gène lin-4, on retrouve le phénotype normal • Curieusement lin-4 ne code pas pour une protéine mais un ARN de 22nt Coenorhabditis elegans (www.wormatlas.org) 0,1mm

  11. Lin-4 et lin-14 • Ambros découvre que la répression a besoin de: • Un lin-4 intact • Une séquence intacte de l’UTR 3’ du gène protéique lin-14 Transcrit de lin 4 stop start UTR 3’ UTR 5’ ORF Transcrit de lin-14

  12. Répression par reconnaissance de l’UTR 3’ • Plusieurs fragments de l’UTR 3’ de lin-14 sont complémentaires à lin-4 • En mutant lin-4 ou l’UTR, on est capable d’abolir ou restaurer la répression du gène lin-14

  13. (He & Hannon, Nature reviews, 2004) Principales étapes de la régulation par lin-4 • Synthèse à partir d’un précurseur • Excision du fragment de 22nt • Appariement imparfait en plusieurs points de l’UTR • Blocage de la traduction par complexe RISC • (Pas de dégradation des ARNm) On retrouve la RNAi!

  14. La découverte s’amplifie • Plusieurs gènes-cibles de lin-4 découverts • En 2000: découverte de let-7, un autre ARN (21nt) qui gouverne le passage L4->adulte • On trouve des homologues de let-7 chez les mollusques, oursin, mouche, souris, homme • Présent chez tous les métazoaires! • Suggère un rôle fondamental

  15. Généralisation • Les microRNA existent chez les plantes et les animaux • Taille entre 21 et 25nt • 500 à 1000 microRNA chez l’homme • Chaque microRNA est capable de réprimer l’expression de plusieurs dizaines de gènes

  16. La biogénèse des miRNA • Deux Rnase III nécessaires • Drosha • Dicer • Drosha laisse un bout 3’ libre de 2nt (He & Hannon, Nature reviews, 2004)

  17. Mode d’action Comme la RNAi! • Dicer puis RISC (He & Hannon, Nature reviews, 2004)

  18. Les multiples modes de silencing

  19. Les microRNA s’expriment spécifiquement • Plusieurs miRNA sont fortement sur/sous-exprimés dans des tumeurs (He & Hannon, Nature reviews, 2004)

  20. Un miRNA peut réprimer plus de 100 transcrits • Injection de miR-1 (coeur + muscle) et miR-124 (cerveau) dans des cellules humaines • Suivi de l’expression par puce ADN • ~200 gènes réprimés • Le miRNA de cerveau réprime des gènes qui ne doivent pas s’exprimer dans le cerveau en temps normal. • IDEM pour miRNA de coeur.

  21. Les gènes réprimés ont un motif commun dans leur 3’ UTR Séquence de 7-8nt « seed » essentielle pour la reconnaissance de la cible

  22. ARN régulateurs bactériens

  23. Début des années 80: • Chez Escherichia coli, de petits ARN (~100nt) peuvent se lier à des séquences complémentaires et inhiber la traduction • Aujourd’hui, environ 25 cas connus d’ARN antisens régulateurs chez E. coli

  24. Les sRNA: la principale famille d’ARN régulateurs chez les bactéries • 80-100nt de long • Pas de processing/clivage • Appariement aux ARNm • Affectent capacité de traduction ou stabilité de l’ARNm • Mediation par protéine chaperone Hfq

  25. Reconnaissance sRNA/mRNA • Le plus souvent en 5’ • Occlusion du site de fixation du ribosome ou du codon Start • Dégradation par RNAse E • Est-elle une conséquence de l’appariement? • Ou une conséquence de l’arrêt de traduction? • RNAse E dégrade aussi le sRNA.

  26. Rôles de Hfq • Intéragit avec régions riches en AU sur le sRNA et sur la cible • Stabilise le sRNA • Stimule appariement entre sRNA et cible

  27. Ryhb et la synthèse de protéines liant le fer • L’ARN Ryhb est normalement réprimé par Fur (Ferric uptake regulator). Reconnaît le promoteur de Ryhb. • En présence de fer: FUR activé. Réprime Ryhb • Fer limitant: FUR inactif. Synthèse de Ryhb • Ryhb se lie avec les mRNA de 5 opérons de protéines liant le fer • Conduit à une rapide dégradation des mRNA • -> Diminution des besoins cellulaires en fer -> redirection des ressources en fer vers protéines essentielles

  28. Caractérisation de Ryhb (2002) • Genome-wide search (bioinformatique) • 26 sRNA potentiels • Complementarités sRNA:mRNA • Plusieurs mRNA utilisant le fer • Vérif: Niveau de sdh inversement proportionnel à Rhyb • Caractérisation au moyen de souches Rhyb-; fur-; avec ou sans fer (iron chelator+) sdhCDAB: opéron succinate dehydrogenase C,D,A,B Eric and Gottesman (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 4620-4625

  29. Egalement: régulation positive • Exemple de la régulation du gène RpoS par DsrA et RprA • Stimulation de RpoS • Cible située ~70nt en amont du début de transcription

  30. Régulation de RpoS par l’ARN DsrA • RpoS est un facteur Sigma alternatif très important pour l’expression de nombreux gènes en conditions de stress. • Etat normal: éteint. La région 5’ est repliée sur elle-même. • DsrA se fixe sur la cible et libèrent le site d’entrée du ribosome Régulation positive par ARN: jamais vu chez les eucaryotes

  31. Conclusion: une variété de mécanismes

  32. Eucaryotes et procaryotes: quelques similitudes S. Gottesman

  33. La recherche de nouveaux ARNnc:Où en est-on?

  34. Approches expérimentales • Cloning • Extraire petits ARN • Cloner et séquencer • cDNA projects • FANTOM3: • 100,000 mouse cDNAs • 32,000 non-coding! • Tiling arrays • Half human transcriptome is polyA-, cytoplasmic and maps unnanotated loci

  35. Limitations • Non détection de transcrits exprimés rarement • Nombreux transcrits non fonctionnels (« fuites » de la transcription) • Pas de preuve de fonction en tant qu’ARN

  36. 95% du génome bactérien est transcrit en ARN

  37. 90% du génome de vertébré est transcrit aussi! Intergenic DNA Introns, UTRs Transcription: T Satellite DNA T? T T T Transposable elements tRNA, rRNA Coding regions: 1.5%

  38. La question n’est plus de savoir ce qui est transcrit mais… • Quels sont les transcrits non codants fonctionnels? • Une aiguille dans une botte de foin!

  39. Bioinformatique: irremplaçable • Méthodes de Détection d’ARNnc fonctionnels • Thermodynamique • GC-content • Covariation/conservation (RNAz, QRNA, Carnac) • Homology-based (Infernal, Erpin) • => Haut sur la liste des priorités de la bioinformatique

  40. Comment les transcrits non-codants échappent-ils aux RNAses III ? • W. Ritchie, M. Legendre, D. Gautheret • RNA, 2007

  41. Qu’est-ce qu’un précurseur de miRNA? • Dicer: min 23bp, max 3 mismatches • Drosha: min 33bp • miRbase: précurseurs de 15bp

  42. Génome humain: 1 tige de 33bp tous les 10kb! Sachant que 90% est transcrit: 300.000 miRNA potentiels. Problème! • >i|29806588|ref|NT_011519.10|Hs22_11676 Homo spiens hromosome 22 enomi oni, referene ssembly(1000001->2000000) 29 60001 128 • gtgcaggg atacagggctcctgtcccagctctg agcctgtcctgccatcccaggtgccccatctgcactctccagacttcatcccctgcaagg tggggctggggtatgggctctgcct gg ccctgccc • >i|29806588|ref|NT_011519.10|Hs22_11676 Homo spiens hromosome 22 enomi oni, referene ssembly(1000001->2000000) 29 111735 116 • tcatgggtagtgcctgct gctggccccagggtt agggctgctcagccagtcctggctggaaaggatgaatgtcccacaagc agctttggggcctgc tt ggtgggagcagcccgagg • >i|29806588|ref|NT_011519.10|Hs22_11676 Homo spiens hromosome 22 enomi oni, referene ssembly(1000001->2000000) 29 113267 156 • ttgtgctttggttttgct tttttagctacatgg tttatgtgaggtgcggacttacttgagttgctctgtctttacagggagcttgctttttctctgctggtttgttttcacttttgctgtct ctgtttagaagaaaa c attagaactggggtgtgg • >i|29806588|ref|NT_011519.10|Hs22_11676 Homo spiens hromosome 22 enomi oni, referene ssembly(1000001->2000000) 29 144296 98 • catcct tttccaggggccagggctgcacacagg 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  43. Autres éléments d’identité? • 5’ Uracil (Lim 2003) • Folding free energy (Lim 2003) • Fréquence de certains mots (Xu, 2005) => Utile mais insuffisant

  44. Autres éléments d’identité dans la structure secondaire? • Prendre les >1000 ARNnc prédits dans le génome humain (Washietl 2005) • Les clusteriser sur la base de leur structure secondaire • RNAforester (Giegerich) => Les pre-miARN se distinguent-ils de tous les autres ARNnc?

  45. RNAforester clustering 67 tiges-boucles ne clusterisent pas avec les miRNAs

  46. « Diffuse hairpins » • Qu’ont-elles de particulier?

  47. Test: co-clustering d’une tige boucle avec les pré-miRNA • Tige-boucle inconnue: • La comparer avec RNAforester à: • 109 pre-mIR • 67 « Diffuse hairpins » • Récupérer les 20 meilleurs scores RNAforester • Noter de 0 à 100 suivant le nombre et le rang des pre-miR • Score final de la structure: • 100: + proche des pre-miR • 0: + éloignée des pre-miR

  48. Résultats: 1000 genomic hairpins 322 real mirs • La structure secondaire permet une bonne séparation entre tiges de l’ADN génomique et pre-miRNA • Les tiges boucles conservées ont des caractéristiques qui les distinguent plus des miRNA que des tiges de l’ADN 322 real mirs using 1000 genomic hairpins as negative set Density Score

  49. Comparaison pre-miR / autres ncRNAs

  50. La structure comme outil de détection des miRNA • Set 1: séquences proches • Set 2: séquences éloignées

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