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Des électrodes pour étudier et utiliser les hydrogénases: du mécanisme catalytique à la biopile

Des électrodes pour étudier et utiliser les hydrogénases: du mécanisme catalytique à la biopile. Christophe Léger, Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, CNRS Marseille. Vincent et al, Chem. Rev. (2007). Liebgott et al, Nat. Chem. Biol. (2010). Vincent et al, Chem. Commun. (2006).

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Des électrodes pour étudier et utiliser les hydrogénases: du mécanisme catalytique à la biopile

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  1. Des électrodes pour étudier et utiliser les hydrogénases: du mécanisme catalytique à la biopile Christophe Léger, Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, CNRS Marseille Vincent et al, Chem. Rev. (2007) Liebgott et al, Nat. Chem. Biol. (2010) Vincent et al, Chem. Commun. (2006)

  2. Hydrogénases NiFe les plus étudiées par des techniques biophysiques au XXe siècle

  3. Hydrogénases NiFe les plus étudiées par des techniques biophysiques au XXeet XXIesiècles * Enzyme tolérant le dioxygène

  4. L’enzyme purifiée à l’air est un mélange de formes inactives Oxydation Formes inactivesNiA + NiB + états silencieux Formes actives (dont NiC) Réduction Hatchikian,Cammack et al., FEBS Letts 142 289 (1982)

  5. Cinétiques complexes d’activation / réactivation Structure des formes inactives encore incertaines NiB (inactif, « ready ») Réduction rapide Oxydation aérobie (par O2) ou anaérobie (DCPIP*) Formes actives Réduction lente NiA (inactif, « unready ») * DCPIP = dichlorophénolindophénol, E0=+200mV Hatchikian,Cammack et al., BBA 883 145 (1986) Volbeda et al., J. Biol. Inorg. Chem. 10 239 (2005)

  6. Les applications des hydrogénases requièrent qu’elles fonctionnent même en présence de dioxygène McKinlay et al., Curr. op. biotech. in press (2010) Vincent et al., Chem. Commun. 5033 (2006)

  7. I. Quelles électrodes pour échanger des électrons avec les hydrogénases?

  8. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Electrode d’or + noir de carbone Hydrogénase de Thiocapsa roseopersicina, adsorbée sur or recouvert de noir de carbone INTRODUCTION: « The investigation of enzymes as catalysts for electrochemical processes is a novel area of chemical enzymology. (…) Besides, it is also of interest to study electrochemically the mechanism of the redox enzyme action ».

  9. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolitique “edge” 2H+ H2 electrons 1μm Les feuillets « graphènes» Image en microscopie électroniqueaprès abrasion mécanique Formation d’un film protéique Amstrong et al., Chem. Soc. Rev. 26 169 (1997) Blanford et al., J. Solid. State Electrochem. 10 830 (2006)

  10. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolytique “edge” Potentiel E En l’absence d’enzyme temps

  11. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolytique “edge” Potentiel E 2H+ H2 H2ase de A. vinosum adsorbée sur électrode immobile, 1 atm. Ar temps electrons Pershad et al, Biochemistry 38 8992 (1999)

  12. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolytique “edge” 1atm H2, électrode tournante, haute vitesse de balayage: 200mV/s (un cycle en 8s) Léger et al., Biochemistry 41 15736 (2002), J. Phys. Chem. B 106 13058 (2002)

  13. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolytique “edge” 1atm H2, électrode tournante, basse vitesse de balayage (0.3mV/s, cette expérience en 1h30) Oxydation Actif Inactif Réduction Jones et al., J. Am. Chem. Soc. 125 8505 (2003)

  14. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Greffage covalent sur graphite fonctionnalisé NO2 NO2 NO2 Allongue et al., J. Am. Chem. Soc. 119 201 (1997) Acides aminés glutamate près du 4Fe distal Orientation favorable et attachement covalent (couplage carbodiimide) Rudiger et al., J. Am. Chem. Soc. 127 16008 (2005) Carbodiimide Protéine Surface Liaison amide

  15. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Greffage covalent sur nanotubes de carbone fonctionnalisés Greffage covalent 50μm Adsorption simple H2ase de D. gigas, pH 7, 1 atm H2, E=-280mV 5μm Alonso-Lomillo et al., Nano Letters 7 1603 (2007)

  16. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Electrode d’or + polymyxine (PM) PM Mica + Au(111) + PM + H2ase A. vinosumImage AFM (tapping mode, in air) 0.23 pmol/cm2 • Au + PM + H2ase A. vinosum, • pH 9, 1mV/s0.13 - 1.3 pmol/cm2 (à partir de valeur de kcat en solution) Hoeben et al., Langmuir, 24 5925 (2008)

  17. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Nanoélectrode d’or + polymyxine 100x100 nm2 Si + 500nm SiO2 + 30nm Au + 300nm PMMA A vinosum H2ase, pH 6, 1.5mV/s Hoeben et al, ACS NANO 12 2497 (2008)

  18. Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Electrode d’or fonctionnalisée D. vulgaris Miyazaki H2ase, pH 5.5, 1mV/s H2 Monocouche auto organisée (SAM) de thiols HS-(CH2)6-NH2 Ar Millo et al, J. Phys. Chem. B 113 15344 (2009)

  19. II. Exemples d’études électrochimiques d’hydrogénases: quels déterminants moléculaires de la résistance à l’oxygène?

  20. Mesure d’activité classique (spectrophotométrie)activité = vitesse de turnover = nbr moles de H2 / sec / enzyme (1000 à 10000s-1) H2 2H+ Pente = vitesse de turnover electrons Méthyl viologène oxydé (incolore) MV réduit (bleu) • Facile • Laborieux: 10-20 minutes • Contraignant: anaérobicité

  21. La mesure électrochimique d’activité • Inconvénient: • Concentration surfaciquele plus souvent inconnue • Avantages: • Quantités minuscules de matériel biologique • Contrôle du potentiel d’électrode • Présence d’O2 permise(à condition que E élevé) • Résolution temporelle 2H+ H2 Electrode de référence Electrode de travail Contre-electrode H2 electrons Electrode tournante, potentiel E Courant = [enzyme] x turnover Léger et al., Chem. Rev.108 2379 (2008). Vincent et al., Chem. Rev. 1074366 (2007)

  22. Des hydrogénases NiFe très similaires montrent des résistances à l’O2 variéese.g. A. vinosum, versusRalstonia eutropha MBH Courant normalisé ( = activité) Courant normalisé ( = activité) A .vinosum1 bar H2, pH 6, 30oC, E=0.14V R. Eutropha MBH Vincent et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 102 16951 (2005)

  23. Le tunnel d’accès du substrat détermine-t-il la sensibilité à l’O2? Tunnel Site actif 1) Val+Leu gardent l’embouchure du tunneldans l’enzyme de D. fructosovorans, standard = sensible à l’O2 Résidus conservés dans la plupart des H2ases NiFe Exceptions: Ile+Phedans enzymes « senseurs » (R. capsulatus, R. eutropha RH) insensibles à l’O2 2) La double mutation Ile→Val / Phe→Leu rend l’enzyme senseur (RH) de R. eutropha sensible à l’oxygène L122 Ni V74 Fe Volbeda et al., Int. J. Hydrogen. Energ. 27 1449 (2002) Buhrke et al., J. Biol. Chem. 280 23791 (2005)

  24. kDa 67 30 Enzyme pure Purification de mutants de l’hydrogénase de D. fructosovorans(S. Dementin, P. Liebgott, CNRS Marseille) temps(jours) 0 ~10 ~20 27 29 Mutagenèse dirigée Transformation de D. fructosovorans Culture Purification V74DV74EV74Q V74N V74W V74M V74C V74S V74K V74I V74C V74H V74FL122ML122C L122FL122A L122M-V74ML122A-V74M L122F-V74IL122C-V74C L122 V74 WT

  25. Activité en solution (S. Dementin, P. Liebgott, BIP.) Structures X-ray(A. Volbeda,CEA,Grenoble) pdb 3CUS pdb 1YQW pdb 3H3X pdb 3CUR ‘

  26. La constante de Michaelis Km Henri, C.R. Acad. Sc.135 916 (1902); Michaelis et al., Biochemisches Zeitschrift 49 333 (1913)

  27. La constante de Michaelis Km H2, then Ar H2, then Ar

  28. La constante de Michaelis Km H2, then Ar

  29. La constante de Michaelis Km

  30. La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur “compétitif”) CO H2

  31. La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur “compétitif”) Inhibition rapide H2 CO

  32. La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur “compétitif”) H2 Léger et al., J. Am. Chem. Soc. 126 12162 (2004)

  33. La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur “compétitif”) Résultat obtenu avec un mutant dont le canal est partiellement obstrué Inhibition lente H2 CO Leroux et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 105 11188 (2008)

  34. La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur “compétitif”) Résultat obtenu avec un mutant dont le canal est partiellement obstrué Réactivation lente H2 Leroux et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 105 11188 (2008)

  35. La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur “compétitif”) Résultat obtenu avec un mutant dont le canal est partiellement obstrué Modélisation → Leroux et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 105 11188 (2008)

  36. La vitesse de la réaction (irréversible) avec O2 Modélisation → Léger et al., J. Am. Chem. Soc. 126 12162 (2004)

  37. k-2 Interprétation: une étape (k1/k-1) de diffusion dans l’un et l’autre sens une étape (k2/k-2) de fixation/dissociation du site actif G k2 k-1 k1 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  38. k-2 Interprétation: une étape (k1/k-1) de diffusion dans l’un et l’autre sens une étape (k2/k-2) de fixation/dissociation du site actif G k2 k-1 k1 4 constantes de vitesse 2 observables Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  39. 10 constantes de vitesse 5 observables Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  40. La vitesse d’inhibition par COest la vitesse de diffusion de COvers le site actif Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  41. à fonction constante, chaine latérale augmentée d’un CH2 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  42. à fonction constante, chaine latérale augmentée d’un CH2 à taille constante, COOH -> CONH2 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  43. Les mutations affectent lesvitesses d’entrée et de sortiede la même façon Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  44. Ralentir la diffusion de O2peut augmenter la résistancede l’enzyme à O2 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  45. Les mutations affectent la vitesse de diffusion de H2 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  46. H2 diffuse par le même canalmais 30 fois plus vite que O2 et CO Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  47. Des tunnels conduisent O2, H2, CO, N2 dans de nombreuses autres métalloenzymes Cytochrome c oxydase (complexe IV) Acétyl-CoA Synthase / CODH (cf. dernier cours) Photosystème II Lipoxygénase FeFe hydrogénase Nitrogénase Lautier et al., Faraday Discussions 148, in press (2010) Salomonsson et al., Proc. Natl. Acad. Sc USA 101 11617 (2004)

  48. Diffusion intramoléculaire dans l’hydrogénase: principaux acquis de l’électrochimie • Les mutations affectent les vitesses de diffusion “in” et “out” • Elles font varier les vitesses relatives de diffusion de H2, CO et O2 • H2 diffuse plus vite que O2 et CO • Des mutations ponctuelles font varier les vitesses de jusqu’à 4 ordres de grandeur. Rôle attendu de la taille et surprenant de la polarité • Ralentir l’accès de O2 augmente la résistance à l’oxygène, à condition que la diffusion de O2 limite la vitesse d’inactivation Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

  49. Ralentir l’arrivée de O2 au site actif ne fait que ralentir l’inhibition ‘ Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)Dementin et al., J. Am. Chem. Soc. 131 10156 (2009)

  50. Inactivation aérobie des H2ases: quelle(s) espèce(s) formée(s)? 1) Hydrogénase standard (D. fructosovorans) 1 2 Enzyme inactivée par O2 dans conditions oxydantes Réactivées dans conditions moins oxydantesCinétique de réactivation multiphasique: plusieurs espèces inactives NiB (inactive, « ready ») Réactivation rapide Active forms Oxydation par O2 Réactivation lente NiA (inactive, « unready ») Lamleet al. J. Am. Chem. Soc. 126 14899 (2004)

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