Selhání Koagulace

1. Selhání Koagulace MUDr. Tomáš Stopka Ph.D. a kolektiv Ústavu patologické fyziologie

2. Plán • Koagulace • Vyšetření • DIC • Terapie • Referát

3. I. Koagulace Initiating the Clotting Process 1. Damaged cells (extrinsic pathway) display a surface protein called tissue factor (TF) that binds to activated Factor 7 (TF-7) to cleave: Factor 10 2. Factor 10 binds and activates Factor 5 (prothrombinase) convertíng prothrombin (also known as Factor II) to thrombin 3. Thrombin proteolytically cleave fibrinogen (Factor I) to fibrin. 4. Factor 13 forms covalent bonds between the soluble fibrin molecules converting them into an insoluble meshwork — the clot.

4. I. Koagulace • Amplifying the Clotting Process • 1. The TF-7 complex also activates Factor 9. • 2. Factor 9 binds to Factor 8, a protein that circulates in the blood stabilized • by another protein, von Willebrand Factor (vWF). • 3. Complex 9-8-vW activates more factors: 5,8,10,11

5. I. Koagulace LUMEN Blood clot WALL Endothelial demage Damaged endothelial cells display tissue factor (TF) that binds to activated Factor 7 (TF-7) to cleave: Factor 10 The intrinsic cascade is initiated when contact is made between blood and exposed endothelial cell surfaces.

6. Heparin binds to and enhances antithrombin III. Warfarin (aka coumadin) is an effective vitamin K antagonist. I. Koagulace • Controlling Clotting Antithrombin III inactivates: prothrombin, factor 9, factor 10 Protein C and its cofactor Protein S together inhibit thrombin formation by inactivating Factor 5 and by inactivating Factor 8. Inherited deficiency(mutations) of Protein C or Protein S (or FV, Leiden)= thrombophilia Vitamin K is a cofactor needed for the synthesis (in the liver) of factors 2 (prothrombin), 7, 9, and 10, proteins C and S Deficiency of Vitamin K predisposes to bleeding. Conversely, blocking the action of vitamin K helps to prevent inappropriate clotting.

7. I. Koagulace • Dissolving clots Plasma plasminogen to the fibrin molecules in a clot. Nearby healthy cells release tissue plasminogen activator (TPA), which also binds to fibrin and, activates plasminogen forming plasmin. Plasmin (serine protease) proceeds to digest fibrin, thus dissolving the clot.

8. I. Koagulace HEMOKOAGULAČNÍ ROVNOVÁHAJE INTEGRÁLNÍ SOUČÁSTÍ ZÁNĚTOVÉ ODPOVĚDI. CÉVNÍ STĚNA ENDOTEL KREVNÍ DESTIČKY PLAZMATICKÝ KOAGULAČNÍ SYSTÉM KOAGULAČNÍ, FIBRINOLYTICKÝ, KALIKREIN-KININOVÝ

9. I. Koagulace PORUCHY HEMOKOAGULAČNÍ ROVNOVÁHY = TROMBÓZY A EMBOLIE TROMBÓZA V MIKROCIRKULACI ŽILNÍ ARTERIÁLNÍ OBECNÉ PŘÍZNAKY - ISCHEMIE TKÁNÍ - OBĚHOVÉ SELHÁNÍ PLICNÍ SYSTÉMOVÁ EMBOLIE

10. I. Koagulace • Časná hluboká žilní trombóza (DVT) A) asymptomatická : způsobuje > 50% PE. B) symptomatická: otok, pasivní bolest nebo palpační bolestivost, změny zbarvení a teploty kůže, Homansův příznak. • Posttrombotický syndrom Příznaky chronické DVT, někdy s latencí 3 - 15 let po inzultu následkem rozvoje zpočátku asymptomatické DVT, náplň povrchových kolaterálních žil, lipodermatoskleróza, varixy, ulcerace - 50% v důsledku DVT. • Plicní embolie (PE) Dle závažnosti: dyspnoe, tachypnoe, tachykardie, pleuritická bolest na hrudi, zvýšená náplň krčních žil, hemoptýza, oběhová nestabilita, oběhové selhání až náhlá smrt.

11. I. Koagulace KRVÁCENÍ Z MALÝCH TRAUMAT - sc., im.vpichy - eroze na sliznicích DIFUZNÍ MIKROVASKULÁRNÍ - purpury - petechie, ekchymozy (>3 mm) - orgánové apoplexie CHIRURGICKÉ A) trombocytopenie B) desintegrace mikrovaskulární intimy nadhraniční trauma i při funkční hemostáze selhání posttraumatické hemostázy - dysfunkce D, PKS, E

12. II. Vyšetření STANOVENÍ ČASU KRVÁCENÍ A REZISTENCE KAPILÁR • Stanovení času krvácení (Duke, 1910) Měří se čas potřebný pro spontánní zastavení krvácení ze standardního vpichu do ušního lalůčku (Duke, 1910) nebo ze standardního řezu na předloktí (Ivy, 1941). Normální čas krvácení je 2 - 5 min. nebo 4 - 8 min., dle metody. Prodloužený čas signalizuje poruchu primární hemostázy - nejčastěji poruchu funkce destiček, těžkou trombocytopenii (<20 000/uL) nebo vonWillebrandovu chorobu (kvant. nebo kval. změny vWf). • Stanovení rezistence kapilár ( Rumpel, Leede) Zjisťuje se počet petechií, které se vytvoří na určité ploše předloktí (4x4 cm) po stlačení známou silou (manžeta 10,5 kPa/10 min) nebo po aplikaci podtlaku (Brown, 1949). V klasickém uspořádání počet petechií > 5 signalizuje zvýšení fragility kapilár. Test slouží především k diagnotice hereditárních purpur (Weber-Rendu-Osler).

13. II. Vyšetření Metody vyšetření srážlivosti plné krve u lůžka • Lee-Whiteův test - koagulační čas plné krve odebrané bez antikoagulancí v polystyrenové nebo skleněné zkumavce při 37oC. Normální hodnoty 4 - 10 min., dle uspořádání. Hrubý orientační test funkce PKS v akutních stavech. • Trombinový čas plné krve - koagulační čas plné krve odebrané bez antikoagulancií ve zkumavce se standardním množstvím trombinu. Slouží pro rychlou orientační kontrolu přítomnosti fibrinogenu (+/-) v krvi při dekompenzaci akutní DIC. • Aktivovaný koagulační čas (ACT) - krev odebraná bez antikoagulancia se aplikuje do zkumavky s kontaktním aktivátorem (silika, kaolin) a v přístroji je při 37oC míchána do odečtení času koagulace. Rutinní použití pro kontrolu heparinizace při mimotělním oběhu a hemodialýze. ACT normální krve je cca 150 s, při heparinizaci pro dlouhodobý MO nebo hemodialýzu 180 - 300 s, při MO v kardiochirurgii > 600 s.

14. II. Vyšetření Laboratorní metody diagnostiky poruch krevních destiček a vWf • Počet krevních destiček (PLT) - normál 150 - 300 000/uL, pro chirurgii optimum > 100 000 /uL. Těžké trombocytopenie PLT < 20 000/ uL - spontánní krvácení a purpury. • Střední objem destiček (MPV) - normál 6 - 9 fL, velké destičky - některé hereditární trombocytopatie. • Agregometrie - fotometrickým nebo impedančním měřením se v kyvetě agregometru stanoví agregace destiček v citrátové plazmě bohaté na destičky nebo v plné citrátové krvi po přidání aktivátoru - ADP, trombinu, kolagenu. Diagnostika především hereditárních trombocytopatií. • Průtoková cytometrie - imunologické stanovení receptorů na destičkách. • Protilátky proti destičkám - diagnostika imunitních trombocytopenií • Stanovení vWf - imunologicky nebo funkčně jako ristocetin kofaktor agregometricky.

15. II. Vyšetření Laboratorní metody diagnostiky poruch PKS Krev odebraná do citrátu sodného se odstředí a získá se tak citrátová plazma chudá na destičky, která se použije k testu. Základní vyšetření • PT - protrombinový čas PT (Quickův test) • APTT - aktivovaný parciální tromboplastinový čas Další statimově dostupná vyšetření v ČR • FBG - stanovení concentrace fibrinogenu v plazmě (normál :2 - 4 g/L). Funkční (klotabilní FBG) nebo imunologická metoda. Diagnostika hypofibrinogenemie (např. při akutní DIC) nebo hyperfibrinogenemie ( při zánětu, FBG je protein akutní fáze) • FDP - imunologické stanovení celkových degradačních produktů fibri(noge)nu (normál: < 1000 ug/L), ELISA nebo aglutinační semikvant. metody. Diagnostika hemokoagulačního rozvratu. Vysoké FDP při hyperfibrino(geno)lýze.

16. II. Vyšetření Statimově dostupná vyšetření PKS (II) • D-dimer - imunologické stanovení FDP specifických pro stabilizovaný fibrin (normál <500 ug/L). Zvýšení D-dimeru je vysoce senzitivní pro diagnostiku DVT/PE, avšak málo specifické. • AT - funkční test stanovení aktivity antitrombinu v plazmě (normál 80 - 100% aktivity kontrolní plazmy ). Při dysregulaci trombinu se AT spotřebovává v inhibičním komplexu TAT, kofaktorem je heparin. Primární nebo sekundární deficience AT (< 75%) představuje riziko trombofilie až rozvoje DIC. • TT - trombinový čas plazmy (normál 17 - 24 s). Přímé vyšetření konverze FBG na fibrin, TT je prodloužen při dysfibrinogenemii, těžké hypo- nebo afibrinogenemii, vysoké hladině FDP (působí antipolymeračně), při heparinové terapii.

17. II. Vyšetření Statimově dostupná vyšetření PKS (III) • Testy běžné v ČR, avšak stále méně používané ve světě - nízká specificita senzitivita • Etanolový test - orientační test na přítombost FDP a fibrinových monomerů v plazmě. V přítomnosti etanolu disociují antipolymeračně působící FDP z přítomných fibrinových monomerů a dochází k tvorbě fibrinového polymeru - vlákna. Normálně je test negativní, pozitivní je při dysregulaci trombinu a plazminu (DIC). • Euglobulinová metoda stanovení fibrinolytické aktivity Z plazmy se vysráží v izoelektrickém bodě kys. octovou euglobulinová frakce obsahující plazminogen, frakce se oddělí, rozpustí a znovu vysráží CaCl2. Přítomný plazmin, precipitací zbavený účinku alfa2 antiplazminu lyzuje vzniklou sraženinu. Při aktivaci fibrinolytického systému je přítomno více aktivovaného volného plazminu a lýza sraženiny je rychlejší. Normální čas lýzy je 240 - 120 min. Kratší časy signalizují zvýšenou aktivaci fibrinolytického systému.

18. II. Vyšetření Speciální vyšetření PKS • Vyšetření systému proteinu C- stanovení proteinu C , Akt. Protein C rezistence (mutace FV), proteinu S • Vyšetření fibrinolytického systému- stanovení aktivátorů plazminogenu tPA , uPA, jejich inhibitoru PAI-1, stanovení plazminogenu, jeho inhibitoru alfa2AP, stanovení lipoproteinu Lp (a) • Vyšetření antifosfolipidových protilátek - lupus antikoagulans (LA) : modif. APTT a spec. koag. Testy na LA, antikardiolipinové protilátky - imunologicky • Vyšetření aktivity jednotlivých faktorů PKS pomocí APTT testu s použitím selektivně deficitní plazmy - diagnostika hemofilie A (FVIII), B(FIX), C (FXI) a dalších deficiencí

19. II. Vyšetření Protrombinový čas PT (Quickův test) • Princip metody: test simuluje hlavní cestu aktivace PKS - cestu tkáňového faktoru (historicky: vnější cesta aktivace). Do citrátové plazmy se přidá přebytek tkáňového tromboplastinu (tkáňový faktor v negativně nabitých fosfolipidech) a CaCl2. V koagulometru se měří čas vzniku fibrinového vlákna. Normální hodnoty: PTN= 12 - 15 s • Prodloužení PT:, deficit FV nebo vit. K dep. FII, VII, X těžký deficit FBG, vysoké FDP, porucha konverze FBG, v určitém uspořádání není ovlivněn heparinem (do 1 U/mL) • Využití testu: screeningový test, řízení orální antikoagulační terapie antagonisty vit. K, test jaterní proteosyntézy (FVII) • Vyjadřování výsledků: a) % protrombinového komplexu, • b) poměr PTP/ PTN, c)mezinárodní normalizovaný poměr INR= (PTP/ PTN)ISI kde ISI = mezinárodní index senzitivity užitého tromboplastinu (většinou > 1). INR je oficiálně určen pouze pro řízení orální antikoagulační terapie (max. terapeut. INR = 4,5), používá se však často všeobecně.

20. II. Vyšetření Aktivovaný parciální tromboplastinový čas APTT • Princip metody: test simuluje kontaktní cestu aktivace PKS (vnitřní cestu). Do citrátové plazmy se aplikuje kontaktní aktivátor (např.kaolin) pro aktivaci kontaktního systému a negativně nabité fosfolipidy pro umožnění tvorby FX- a FII- aktivačních komplexů. Plazma se rekalcifikuje CaCl2 a v koagulometru se měří čas do vzniku fibrinového vlákna. Normální hodnoty: APTTN = 27 - 35 s • Využití testu: screeningový test, diagnostika deficitu faktorů “vnitřního“ systému, lupus antikoagulans, řízení heparinové terapie. • Prodloužení APTT: deficit FII,V, X, deficit kontaktních faktorů - F XII, PK, HMWK, deficit FXI, FIX , FVIII (hemofilie C, B,A), lupus antikoagulans, těžkýdeficit FBG, vysoké FDP, porucha konverze FBG. • Zkrácení APTT: protrombotický stav • Vyjadřování výsledků: APTT pacienta, APTT kontroly (normálu), při heparinové terapii řízené APTT požadováno 1,5x - 2,5 x prodloužení.

21. PLT BT APTT PT TT FBG Porucha Trombocytopenie L P N N N N N N P N N N N N P N N N N N P N N N N P N/P N N N N N P N/P N N II. Vyšetření Pravděpodobné výsledky laboratorních testů při různých poruchách hemostázy (I) Hemofilie A Hemofilie B Hemofilie C vW-choroba LA

22. II. Vyšetření Pravděpodobné výsledky laboratorních testů při různých poruchách hemostázy (II) Porucha PLT BTAPTT PT TT FBG FV-def. FII-def. FVII-def. Vit.Kdef./OA FBG-def. Heparin N N P P N N N N P P N N N N N P N N N N P P N N N N P P P L N P/N P N/P N N

23. III.DIC Definice Narušení rovnováhy mezi jednotlivými složkami hemostatických mechanismů. Vždy doprovází jinou chorobu DIFF (diseminovaná intravaskulární formace fibrinu)

24. III.DIC Etiopatogeneze Průnik substancí aktivujících srážení krve do oběhu tkáňový faktor (vnější systém F X, VII, V, Ca) krevní tromboplastin, trombokináza (vnitřní systém F XII, XI, IX, X, VII, V, K) Přímá intravaskulární aktivace koagulace Selhání inhibičních mechanismů koagulace a monocyto-makrofágového systému

25. III.DIC Rozdělení DIC  Akutní (dekompenzovaný, high-grade) život ohrožující stav Chronický (kompenzovaný, low-grade) prolongovaná alterace hemostatických mechanismů nevýrazná klinická symptomatologie

26. Heat stroke Sepsis Viremia Pancreatitis Neoplasia (Diffuse and local) Parasitic Infections Intravascular Hemolysis Immune-mediated Diseases Exposure to venom/toxins Massive tissue injury (including burns, crush trauma, and surgical procedures) ObstetricComplications Insufficiency of major organs (Liver, Kidney) Diabetes mellitus Acidosis Polycythemia Severe prolonged hypotension (including shock) Severe volume depletion Impaired blood flow to a major organ Conditions Associated with DIC

27. Activation of the coagulation cascade results in increased levels of circulating thrombin and plasmin. Thrombin cleaves fibrinopeptides A and B from fibrinogen, leaving soluble fibrin monomers as the end product (Figure 1). Activation of factor XIII results in polymerization of these fibrin monomers into insoluble cross-linked fibrin clots. DIC • Increased levels of circulating plasmin causes clot lysis and degradation of fibrinogen and the soluble fibrin monomers. • Plasmin cleaves fibrinogen into fragments X,Y,D, and E, known as fibrinogen degradation products (FDPs). • Plasmin also cleaves insoluble cross-linked fibrin polymers into x-oligomers. The main x-oligomers are known as d-dimers. What are FDPs and D-dimers and how do they relate to DIC?

28. What are FDPs and D-dimers and how do they relate to DIC? FIBRIN • Monoclonal antibodies have been generated which recognize the cross-linked domain of d-dimers as an antigenic target. These antibodies are used in all available d-dimer assays. • Quantitative tests for d-dimers are available, including enzymatic immunoassays (ELISA) and immunoturbidometric systems.

29. III.DIC Klinické příznaky  1 Makro- a mikrotrombóza + selhání cílových orgánů 2 Krvácení Kombinace těchto projevů 3 Modifikace základním onemocněním Rychlost aktivace koagulace

30. III.DIC Diagnóza  Anamnéza Objektivní nález základní onemocnění klinická symptomatologie Laboratorní diagnóza Negativní laboratoř nevylučuje DIC !!!

31. III.DIC Laboratorní diagnóza NORMA  • PLT   150 - 300 000 x 10 exp9 /l • APTT   30 - 35 s • AT    80 - 140 % • TT    14 - 16 s • FBG   2.5 - 5 g/l • FM (etanol test)    • DD    < 500 ng/ml • FDP   

32. III.DIC Laboratorní diagnóza DIC  • PLT   sníženy • APTT   zkrácený nebo prodloužený • AT    snížený • TT    prodloužený • FBG   snížený • FM (etanol test)  pozitivní • plazminogen  snížený • DD    pozitivní • FDP   pozitivní • euglobulinová lýza norm. - prodloužená

33. III.DIC • Laboratorní diagnóza “SUMMARY” • PLT • FBG • DD • AT • opakovat v intervalech 3-4h

34. III.DIC • Stadia DIC  1 Hyperkoagulační klinicky němé 2 Přechod do hypokoagulace krvácení z vpichů, chabá koagulace, trombózy v mikrocirkulaci 3 Hypokoagulace s masívní fibrinolýzou masívní krvácení, nesrážlivá krev, orgánové selhání (MOF) - mikrotrombózy 4 Laboratorně neměřitelné hodnoty

35. III.DIC • Diferenciální diagnóza  1 Masívní krevní převody či hemodiluce 2 Stavy se zvýšeným FDP a DD operace, porod, trauma, embolizace 3 HIT/HITT heparinem indukovaná trombocytopenie /+ trombóza 4 DIC like sy (TTP, HUS) 5 Lupus anticoagulans katastrofická forma (pozitivní APA)

36. Thrombotic Thrombocytopenic Purpura Peripheral smear showing microangiopathic hemolytic features with numerous RBC fragments (helmet cells/schistocytes). Marked thrombocytopenia is evident. Renal biopsy showing hyaline thrombi in the glomerulus and small arterioles. von Willebrand factor protein multimer analysis on agarose gel electrophoresis. Lane 1. - normal plasma. Lane 2. - patient plasma when symptomatic. Multimer pattern is similar to the control plasma. Lane 3. - patient plasma after response to pheresis. Note the presence of ultra-large high molecular weight multimers.

37. Researchers Pinpoint Cause of Deadly Blood-Clotting Disorder • Several earlier studies had implicated a clotting-related protein known as von Willebrand factor (VWF) in the disorder. These studies found that the blood of patients with TTP showed an abnormally large form of the VWF protein that had not been cleaved into two smaller sizes, as is normally the case. Thus, said Ginsburg, many scientists believed that a defect in a protein- clipping enzyme known as a protease might be responsible for the disorder. • One of the keys to identifying the gene mutations that underlie TTP was the development of a precise assay for detecting VWF protease activity. Han-Mou Tsai, a senior author of the Nature paper, and colleagues at Montefiore Medical Center and Albert Einstein College of Medicine developed the assay and applied it to blood samples that were provided by members of four families that had an inherited form of TTP. The assays clearly revealed that within these families, those who had TTP showed low VWF protease activity, while carriers of the disease showed medium levels of protease activity, and unaffected individuals showed normal levels. • Using results from the assay as a guide, Gallia G. Levy, lead author of the Nature article, performed linkage analyses of the family members and determined which of known genomic markers were inherited with the disease gene. These studies enabled her to narrow down the region containing the disease gene to a specific region of chromosome 9. • Levy then obtained the full gene sequence and proceeded to test the other patients for mutations in the gene, which they named ADAMTS13. Levy subsequently identified a dozen mutations in the gene among the patients, accounting for nearly all the cases of TTP. According to Ginsburg, Levy’s findings open the way to understanding how and why the ADAMTS13 protease cleaves VWF and how the failure to cleave the protein causes disease.

38. III.DIC Terapie 1:  Přerušení aktivace koagulace  • 1 Heparin nefrakcionovaný • 5-10 IU/kg/h • bolus 2500 IU, poté inf. do 10 000 IU/24h • LMWH

39. III.DIC Terapie 2:  Přerušení aktivace koagulace  • 2 AT (Antitrombin III, Kybernin P) • při méně než 60%, cílem 100 - 150% • 500 - 1000 IU jako bolus • KI nejsou známy • biologický poločas 3-4 dny, u sepse několik hodin

40. III.DIC Terapie 3  Substituční léčba • 3 Čerstvě zmražená plazma • 15 ml/kg při APTT více než 1.5 R • 4 Fibrinogen • při poklesu 1.0 g/l (maximálně 2g/24h) • obavy z podnícení konzumpce • 2 - 4 g v infúzi

41. III.DIC Terapie 4  Substituční léčba • 5 Čerstvá krev • 6  Krevní destičky • 1 jednotka/10kg • Antifibrinolytika ne !!! • pouze po konzultaci s hematologem

42. III.DIC Terapie 5  Obecná léčba • 1 Léčba šoku • 2  Doplnění objemu • 3 Úprava vnitřního prostředí • 4 Širokospektrá ATB • 5 Operační výkony k zástavě krvácení

43. Prevence - miniheparinizace • 1 eklampsie,   preeklampsie • 2 tromboflebitis anamn. • 3 poruchy srážlivosti krve (protein C, AT III) • 4 mrtvý plod • 5 opakované revize  dutiny děložní • 6 septický porod  (potrat) • 7 transplacent. průnik • 8 placenta praevia • 9 atonie dělohy • 10 placenta accreta • 11 větší krevní ztráta • 12 abrupce placenty • 13 SC iterativa • 14 obezita • 15 vyšší věk (33 let) • 16 rozsáhlejší porodní  poranění • 17 mola hydatidosa • 18 DM

44. III.DIC

45. Acute DICDIAGNOSIS • Clinical findings Multiple bleeding sites Ecchymoses of skin, mucous membranes Visceral hemorrhage Ischemic tissue • Laboratory abnormalities Coagulation abnormalities: prolonged prothrombin time, activated partial thromboplastin time, thrombin time; decreased fibrinogen levels; increased levels of FDP (eg, on testing for FDP, D dimer) Platelet count decreased as a rule but may be falling from a higher level yet still be normal Schistocytes on peripheral smear

46. Chronic DIC DIAGNOSIS • Clinical findings Signs of deep venous or arterial thrombosis or embolism Superficial venous thrombosis, especially without varicose veins Multiple thrombotic sites at the same time Serial thrombotic episodes

47. Chronic DIC • Laboratory abnormalities Modestly increased prothrombin time in some patients Shortened or lengthened partial thromboplastin time Normal thrombin time in most patients High, normal, or low fibrinogen level High, normal, or low platelet count Increased levels of FDP (eg, on testing for FDP, D dimer) Evidence of molecular markers* (eg, thrombin-antithrombin complexes, activation markers on platelet membranes, prothrombin fragment F1+2)

48. Current Management of DIC • At present, diagnosis requires a set of blood tests; therapy focuses on reversing the underlying disorder and providing supportive treatment.

49. Case 1 Presentation • A 56-year-old man was admitted to the emergency department after a car accident. • He had several bone fractures, a cerebral contusion, and hemodynamic instability caused by a ruptured spleen. • Emergency splenectomy and aggressive administration of fluids restored hemodynamic stability, and the patient was transferred to the intensive care unit (ICU). A few hours later, profuse extravasation was noted from the abdominal drains, endotracheal tube, and puncture sites of all intravascular lines.

50. Case 1 Presentation • Laboratory tests showed a rapidly falling hemoglobin level and a platelet count of 25,000/µL. • The activated partial thromboplastin time (aPTT) was 44 sec (normal, <28) and the prothrombin time (PT) was 29 sec (normal, <12.5). • The level of fibrinogen degradation products was 360-520 g/L (normal, <40) and the plasma antithrombin III level was 28% (normal, 80-120).