Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos

1. Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos

2. Nutrición • Dependencia metabólica del hospedero • Capacidad biosintética limitada • Conocimiento derivado de cultivos y en pocas especies • Single omissiontests: difícil sacar conclusiones • Sustancias nutritivas universales: HC, aa, vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas

3. Nutrición - Mecanismos • Difusión simple: moléculas no polares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas • Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad • Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración • Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis

4. Glúcidos • Transporte mediado en membranas celulares • T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b) fructosa y glucosamina • T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de glicerol • E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso limitante • Plasmodium: modulación de la membrana de la célula huésped (eritrocito) con poros.

5. Caso: Metabolismo de Galactosa en Trypanosomabrucei. • El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de T. brucei. • Gal está presente en cantidades importantes en las VSG • Los transportadores de hexosas de T. brucei son incapaces de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP-glucosa 4´epimerasa (galE).

6. Glicoconjugados de superficie en Trypanosoma brucei

7. Mutante condicional null para galE • Bajo condiciones no permisivas que induce la deprivación de Gal. • Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de galE • Después de 96h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar. Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.

8. Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T. brucei y contenido de nucleótidos • Growth of galE-cKO with and without Tet • (B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the galE-cKO without Tet • (C) Sugar nucleotide levels of the galE-cKO Tet cells. • Los niveles celulares de UDP-galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.

9. Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina

10. Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol

11. Aminoácidos • Translocación – mediada en su gran mayoría • Endocitosis de proteínas. • T. brucei: 4 sitios operativos • T. cruzi: Arg altamente específico, con 3 sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala • Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma

12. Caso: la Arginina es un aa esencial para Toxoplasma gondii • En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato • T. gondii carece del gen de la CPSI • Deprivación de Arg bloquea multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.

13. Deprivación dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos Verde: proteína expresada por taquizoítos Rojo: proteína expresada por bradizoítos Azul: núcleos teñidos con DAPI A: 48hs medio normal B: 48hs medio sin Arg C: 7 d sin Arg D: 14 d sin Arg E: Contraste de fase de D F: Cepa PLK 4 d sin Arg

14. Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium

15. Hemoglobina • 95% de lasproteínastotales de GR • Abundante (>300 mg/ml o approx 5 mM) • 60-80% esdegradadadurante el estadioeritrocitario • 110 g (en un total de 750) se consumen en 48 hs con unaparasitemia del 20%

16. Merozoíto entrando un GR Trofozoíto en GR

17. Endocitosis del citoplasma eritrocitario cytostome food vacuole pinocytosis (rings)

18. Vacuola DigestivaUn lisosoma especializado ATP digestion de hemoglobina H+ (pH 5-5.4) ADP • Proteasas de la vacuola • plasmepsinas I & II (aspártico) • falcipainas I - III (tiol) • falcilysinas (metallo) Camino endocítico citoplasma parasitario

19. El clivaje inicial de plasmepsinas es específico y conduce a la desestabilización de la Hb • Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadenas α) • ‘región bisagra’ • conservada • Importante para estabilizar el tetrámero • Se forman fragmentos grandes de globina suceptibles de proteólisis posterior • Se libera Heme a-F33/L34 í

20. hemoglobina plasmepsina fragmentos de globina grandes + heme falcipaina plasmepsina fragmentos medios (20 aa) Fragmentos chicos (6-8 aa) falcilysina La digestión de la Hb es un proceso ordenado • Exopeptidasa? • Amino acidos libres?

21. La vacuolaDigestiva de PlasmodiumUn lisosomaespecializado ATP hemoglobin proteins plasmepsin H+ globin fragments ADP heme + amino acids falcipain plasmepsin falcilysin amino- peptidase ATP Pfmdr-1? small fragments (6-8 amino acids) ADP

22. El Heme libre es tóxico • Desestabiliza y lisa membranas • Las hidrolasas se liberan en el citoplasma del parásito • El parásito muere • Posible Mecanismos de Detoxificación • heme  hemozoína (pigmento malárico) • Degradación mediada por H2O2 o GSH • heme oxigenasa (sólo P.b. and P.k.)

23. Hemozoína = b-Hematina b-hematina heme

24. b-hematina forma cristales insolubles 'biocristalizacion' or 'biomineralización'

25. La vacuoladigestivaUn lisosomaespecializado ATP hemoglobin H+ plasmepsin Fe2+ O2 ADP globin fragments Fe3+ heme + amino acids -O2 O2 falcipain plasmepsin falcilysin ? amino- peptidase • Fe se oxida después de liberarse de la Hb • La oxidación promueve la formation of ROI • Estrés oxidativo hemozoin ATP small fragments (6-8 amino acids) Pfmdr-1? ADP

26. Nucleótidos • No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo • Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos • En kinetoplástidos adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina • Locus para transporte de nucleósidos • Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie • Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina

27. Transportadores de purinas en Plasmodium

28. Vías de salvataje de purinas en parásitos

29. Lípidos • Transportadores para AG • Difusión pasiva para AG no disociados • Apicomplexa: transporte a través de vacuola parasitófora • Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria • Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto

30. Metabolismo del colesterol en Toxoplasma gondii

31. METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS Generalidades Objetivos del metabolismo energético • a)   Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía • b)   Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas

32. Esquema de MetabolismoEnergético

33. KINETOPLASTIDOS • Trypanosoma brucei como modelo: • a)     Depende únicamente de glicólisis para producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol • b)    Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR en formas circulantes • c)     Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma • d)    Flujo glicolítico es relativamente alto • e)     Enzimas glicosómicas no glicolíticas deprimidas

34. Glicólisis • Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200. • Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas. Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O2 dentro de la mitocondria • Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa. • Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma. • Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO2, ALA y ASP

35. Glicólisis y glicosomas

36. Metabolismo energético en formas circulantes y proçíclicas de T. brucei

38. Amebas Intestinales y Giardia • Glicolisis viaEmbden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol • Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa • Sin citocromos • Almacenan glucógeno • Toleran bajas concentraciones de oxígeno

39. Glucolisis

40. Glucolisis anaerobia

41. Mitosomas • Descrito en E. histolytica, G. lamblia • El origen mitocondrial del mitosoma está apoyado por: • i) Doble membrana • ii) localización de proteínas de la maquinaria del clusters de Fe-S (ej. Ferredoxina) • iii) Transporte al mitosoma por medio de secuencias N-terminales similares a las secuencias mitocondriales

42. Enzimas glicolíticas de Entamoebahistolytica

43. Trichomonas • Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO2 y H2O • La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones • La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H+ es el aceptor final de los electrones

44. Hidrogenosomas • Organelos de eucariotesanaeróbicosquegeneranhidrógenomolecular • 1 um, doblemembrana • Compartenancestro con mitocondrias • Tricomonas, ciliadosanaerobios, hongos

45. CO2 hsp70 Protein import ME Malate Pyruvate cpn60 Transit peptides AAC NAD(P)H NAD(P)+ ATP N ADP NAD(P)-FO [Fe]Hyd H2 2Fd 2Fd- 2H+ ASCT Acetate Acetyl-CoA PFO Succinate Succinyl-CoA CO2 Double membrane CoASH STK Fungi and Trichomonas ADP + Pi ATP Enzyme found also in mitochondria Alpha-proteobacterial ancestry Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993) Unknown ancestry

46. Generación de ATP en Hidrogenosomas

47. Acidocalsomas Organelos ácidos Almacenan calcio En varios microorganismos Primero definidos en tripanosomátidos Alta densidad electrónica Alta concentración de fosfatos, Ca++., Mg++

48. Apicoplastos • -Organelo cloroplasto-símil • Viasbiosintéticas de origen cianobacteriano • -Producto de la endosimbiosis secundaria de una cianobacteria y un eucariote • -En Apicomplexa • -Semiautónomos, genoma propio reducido