Produção de Aminoácidos

1. Produção de Aminoácidos

2. Produção de Aminoácidos • Interessam apenas a-L-aminoácidos • vantagem da síntese microbiológica • desvantagem: vias de síntese altamente reguladas • Alto consumo energético. COOH • nutrição humana e animal • agentes flavorizantes • cosméticos • medicamentos • alimentação intravenosa H2N H ala Movimenta US $1,9 bilhões anuais CH3

3. Aminoácidos Essenciais Metionina* Treonina Lisina* Leucina Isoleucina Triptofano Fenilalanina Histidina *são deficientes na maioria dos cereais.

4. Produção • Hidrólise de proteínas • Síntese química • Transformação enzimática • Produção microbiológica • Produção direta a partir de substrato barato • Biotransformação de precursor barato

5. Condições Gerais de Fermentação • Alto consumo de oxigênio • Consequente aumento acentuado de temperatura 28 a 38 oC. • Correção do pH com NH3 (que também servirá de fonte de nitrogênio). 3,44 kcal.g-1 de O2 consumido

6. Recuperação do produto • Acidificação até o ponto isoelétrico • Troca iônica • Eletrodiálise • Extração por solvente orgânico

8. Aminoácido (metric tons) Métodos Uso L-Alanina 130 1,3c Realce de sabor DL-Alanina 700 2 Realce de sabor L-Arginina 1.000 1,3a Parenteral, cosméticos L-aspartato 4.000 1,3c Realce sabor, aspartame L-asparagina 50 1,2 terapêutica L-cisteína 700 1 Aditivo pão, antioxidante L-glutamato 370.000 3a Realce de sabor L-glutamina 500 3a terapêutica Glicina 6.000 2 Síntese orgânica L-histidina 200 1, 3a terapêutica L-isoleucina 150 3a parenteral L-leucina 150 1, 3a parenteral L-lisina 70.000 3c, 3a Parenteral, Aditivo alimentar DL-metionina 70.000 2 Aditivo alimentar L-metionina 150 3c terapêutica L-ornitina 50 3c, 3a terapêutica L-fenilalanina 3.000 3c, 3a Terapêutica, parenteral, aspartame L-prolina 100 3a parenteral L-serina 50 3b, 3a cosméticos L-treonina 160 3a Aditivo alimentar L-triptofano 200 3c, 3a Parenteral, terapêutica L-tirosina 100 1, 3c parenteral L-valina 150 3c, 3a parenteral 1 - Hidrólise de proteínas 2 - Síntese química 3a - Fermentação direta 3b - Transformação microbiana de precursores 3c - Uso de enzimas ou células imobilizadas.

9. Aminoácido (metric tons) Métodos Uso L-Alanina 130 1,3c Realce de sabor DL-Alanina 700 2 Realce de sabor L-Arginina 1.000 1,3a Parenteral, cosméticos L-aspartato 4.000 1,3c Realce sabor, aspartame L-asparagina 50 1,2 terapêutica L-cisteína 700 1 Aditivo pão, antioxidante L-glutamato 370.000 3a Realce de sabor L-glutamina 500 3a terapêutica Glicina 6.000 2 Síntese orgânica L-histidina 200 1, 3a terapêutica L-isoleucina 150 3a parenteral L-leucina 150 1, 3a parenteral L-lisina 70.000 3c, 3a Parenteral, Aditivo alimentar DL-metionina 70.000 2 Aditivo alimentar L-metionina 150 3c terapêutica L-ornitina 50 3c, 3a terapêutica L-fenilalanina 3.000 3c, 3a Parenteral, aspartame L-prolina 100 3a parenteral L-serina 50 3b, 3a cosméticos L-treonina 160 3a Aditivo alimentar L-triptofano 200 3c, 3a Parenteral, terapêutica L-tirosina 100 1, 3c parenteral L-valina 150 3c, 3a parenteral 1 - Hidrólise de proteínas 2 - Síntese química 3a - Fermentação direta 3b - Transformação microbiana de precursores 3c - Uso de enzimas ou células imobilizadas.

10. Flavorizantes Sabores: Doce Amargo Salgado Azedo Umami*

11. 66 % alimentação humana 31 % rações animais 4% cosméticos L-lisina, L- triptofano, L-metionina, L-treonina usados como complementos em alimentos de origem vegetal. L-fenilalanina e ácido L-aspártico = aspartame. Fibras de polialanina e resinas de isocianato de lisina. L-histidina ácido urônico usado como bronzeador.

12. Estratégias • - Uso de cepas desreprimidas • Combinação de síntese química, enzimáticas e microbiológica. • Adaptação para uso de matérias primas mais baratas. • Otimização dos aumentos de escala. DNA recombinante Fusão de protoplastos mutações

13. Microrganismos mais usados Escherichia coli Serratia marcescens Corynebacterium glutamicum Brevibacterium lactofermentum B. flavum. Controles: Enzimas reguladoras Expressão Gênica

14. glutamato prolina Inibição alostérica Glutamato kinase ativa Glutamato kinase inativa

15. Repressão da transcrição RNA polimerase Promotor argB argc argH arginina Proteína repressora Promotor argB argc argH

16. Produção de mutantes

17. Replicação de Colônias

18. Semeadura de prototróficos Agente mutagênico Semeadura em meio contendo Penicilina e sem o aminoácido alvo. Protróficos são mortos ao tentarem se reproduzir Produção de auxotróficos Como são incapazes de produzir um determinados aminoácido, os auxotróficos formados não tentam se reproduzir. Ao ficarem quiescentes quando semeados em meio contendo penicilina, eles conseguem sobreviver Semeadura em meio sem Penicilina mas com o aminoácido alvo Crescimento dos auxotróficos

19. Obtenção de superprodutores de L-ornitina L-ornitina L-citrulina • Seleção de auxotrófico para arginina. • Semeadura em meio contendo citrulina. • Somente crescerão auxotróficos capazes de transformarem a citrulina em arginina. L-arginina

20. Obtenção de superprodutores de L-ornitina L-ornitina L-citrulina Certeza de que o bloqueio acontece na primeira reação do processo L-arginina

21. Ácido Glutâmico • Realçador de sabor (Aji-no-moto) • Demanda anual mundial de 1.500.000 ton • Pode ser obtido por hidrólise ácida de proteínas ou síntese • química mas fornece o isômero D, que é insípido. • Produtores • Corynebacterium glutamicum • Arthrobacter sp • Brevibacterium flavus

22. Condições de Fermentação • Se for dada quantidade suficiente de biotina o microrganismo produz ácido láctico, somente em quantidades sub-ótimas o glutamato é formado. • Geralmente necessário um agente quelante do ferro. • pH ótimo de 7,0 a 8,0. • Abundante suprimento de O2 para evitar a formação de lactato. • 35-37 oC. • Fontes de carbono: • Amido hidrolisado • melaço de cana • melaço de beterraba

23. Biorreatores usados na produção de glutamato monosódico e lisina, cada um com capacidade de 2.410 hl. Por se tratar de metabolismo aeróbio cada um deles apresenta uma saída de gases

24. CO2 Via de Embden –Mayerhoff, seguido do ciclo de Krebs, em que o acetil-CoA é “moído”, para produção de NADH+H+ e GTP.

25. CO2 Se houver inibição da alfa-cetoglutarato desidrogenase ou se o microrganismo for deficiente na produção desta enzima, a via será desviada para a produção de ácido glutâmico.

26. CO2 A estratégia celular compensa o bloqueio realizando um “curto circuito” através do ciclo do glioxalato, resultando neste ácido e no succínico. Começa a haver competição entre as duas vias, até que praticamente todo o substrato se transforma em glutamato. Isocitrato liase Malato sintase

27. CO2 Com o contingenciamento da biotina (essencial para o metabolismo lipídico) a bicapa da membrana se desorganiza, deixando o ácido glutâmico vazar para o meio de cultivo. Outra estatégia consiste em adicionar penicilina ao meio de reação, havendo a desorganização da parede celular.

28. Lisina • Essencial • Peixes e soja são ricos • Usada como suplemento na forma de sais • Produção estimada em 40.000 ton (80% por fermentação) • Lisina rúmen bypass (passa pelo rúmen e vai enriquecer a carne e o leite.

29. aspartato Auxotróficos desta via metabólica não produzem treonina, diminuindo o feedback negativo sobre a aspartato quinase. Suplementa-se o meio apenas com o mínimo necessário dessa vitamina, para a sobrevivência do microrganismo. aspartato kinase aspartato semialdeído homoserina desidrogenase Ácido dihidropicolínico homoserina lisina metionina treonina oxibutirato Existem atualmente auxotróficos deste gênero que também possui um centro regulatório defeituoso na aspartato kinase. isoleucina

30. Fermentação Melaço de cana Melaço de beterraba Hidrolisado de amido Eventualmente etanol ou acetato Substratos: • Biotina é usada (~50 mg.l-1) para prevenir a perda do ácido glutâmico. • 28 – 33 oC. • alta aeração • ciclo fermentativo de 48 a 72 h. • isolamento por troca iônica. • transformada em lisina monohidroclórica.

31. Ácido Aspártico e Aspartame • Precursor, com a fenilalanina, do aspartame • Quimicamente se forma ~40% do seu enantiômero b com sabor amargo de • difícil separação. • Melhor forma é a via enzimática. A Thermolysin, extraída de microrganismos termofílicos opera a 50 – 60 oC. - Mercado mundial: 2000 ton e 100 milhões de dólares/ano

32. Produção de Aspartame Leito empacotado, contendo E. coli, grande produtora de aspartase, encapsulada em gel de carragenanos.

33. Vitamina B12 Carência: Desordens interstinais Anemia perniciosa Produtores: Pseudomonas denitrificans Propionibacterium shermanii Streptomyces Antigamente era subproduto da produção de antibióticos. Hodiernamente a demanda é muito maior. US$8000/kg.

34. Substratos: Milhocina Farelo de soja Farinha de peixe Extrato de carne Hidrolisado de caseína Adição: Carboidratos Hidróxido de amônio Após a fermentação a célula é centrifugada. Grosso da produção, no interior celular. Tratamento com ácidos, cianeto etc. Resina de troca iônica. Purificação em fenol e água.

35. Riboflavina – B2 Deficiência: Feridas nos lábios Úlceras na boca Erupções na pele Problemas de visão Produtor: Ashbya gossypii cepa produtora produz 20.000 x o necessário para o seu metabolismo. Condições: Fermentação aeróbicacontínua em milhocina Recuperação do meio de cultivo.