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Transcription in vitro : principe et applications

Transcription in vitro : principe et applications. MEB MANO Jordi – L3 Biologie Santé. Principe. D’après In vitro transcription and translation , Genetics Wiki. . Utilisation des principes de la transcription in vivo dans un système hors-cellule.

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Transcription in vitro : principe et applications

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Presentation Transcript

  1. Transcription in vitro : principe et applications MEB MANO Jordi – L3 Biologie Santé

  2. Principe D’après In vitro transcription and translation, Genetics Wiki. • Utilisation des principes de la transcription in vivo dans un système hors-cellule. • ADN à transcrire sous forme de plasmide généralement. • Promoteurs forts utilisés : Bactériophages T7, T3 ou SP6.

  3. Matériel nécessaire • Exemple du plasmide LITMUS (Evans et al., 1995) • ADN plasmidique : • Séquence d’intérêt (ADNc) • 2 promoteurs opposés (T7 ou autre) • Un site de restriction unique dans chaque promoteur • Pas de terminaison nécessaire D’après Principes de génie génétique • ADN polymérase(s) spécifique(s) du promoteur • Solutions de ribonucléosides triphosphates • Autres : tampon (Mg2+,…), DNaseI, milieu sans RNase,…

  4. Applications • Traduction in vitro • Protection à la RNase • Détermination de protéines se fixant à l’ARN • Synthèse d’ARN antisens et siRNA • Micro-injections • Synthèse de sondes d’hybridation : • Puces à ADN • Blotting • Hybridation in situ

  5. Synthèse de sondes ARN • Exemple du plasmide LITMUS (Evans et al., 1995) • Activité des promoteurs malgré la présence des sites de restriction • Transcription dans le sens désiré : digestion par une des deux enzymes de restriction avant transcription D’après Principes de génie génétique • Marquage de la « ribosonde » possible et facilité par la linéarisation du plasmide (haptènes, isotopes radioactifs,etc.)

  6. Exemple d’utilisation de sondes ARN • Cas de l’hybridation in situ D’aprèsDevelopmentalBiology 9e Online Transcription de la ribosonde marquée à la digoxigénine (Dig) Hybridation avec l’ARNm cible Lavage-élimination hybrides non spécifiques 4) Ajout d’un anti-corps anti Dig couplé à une phosphatase alcaline 5) Lavage 6) Réaction enzymatique et coloration

  7. Avantages/Inconvénients Avantages • Grandes quantités d’ARN synthétisées • Rapide • Marquage au cours de la synthèse • Sondes très marquées: activité spécifique élevée • Sondes sens et anti-sens • Hybridation très stable (ARN/ADN ou ARN/ARN) • Inconvénients • Grande taille de la sonde : pénétration difficile dans le cas de l’hybridationin situ • Hybridation à haute température • Sensibilité aux RNases : préparation et stockage plus difficiles

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