IN VITRO

1. INVITRO Zpracovatel: Jiří Horák

2. IN VITRO • In vitro se dá z latiny přeložit jako ve skle. Pojem pěstování "in vitro" se používá v medicíně či biologii a v příbuzných oborech pro organismy pěstované v umělých podmínkách ve zkumavkách či jiném laboratorním skle (např. Petriho miskách), ne však na živé tkáni.

3. Základní členění orgánové kultury pletivové kultury buněčné kultury

4. Orgánové kultury • - kultury geneticky stabilní • - technologicky nejméně komplikované • - nedochází k chromozomovým změnám • - nejčastěji používán apikální meristémy,které mají vysoce stabilní struktury • - jež zaručují diploidní charakter reprodukce a genetickou stabilitu .

5. - nejčastěji používány pro většinu našich hospodářsky významných listnatých druhů • - (u druhů rodu Quercus, Fagus, Populus, Betula, Tilia, Fraxinus, Ulmus, Acers, Alnus, Carpinus, Salix, Prunus, Robinia, Juglans). • - Koeficient množení je při použití této metody velký

6. - Nejsnadněji se množí a značných koeficientů množení lze dosáhnout při odebrání explantátů z juvenilních rostlin (semenáčků), nebo z juvenilních částí stromů • - Rozmnožování konifer pomocí orgánových kultur je obtížnější než u listnatých stromů zejména z důvodů jejich odchylné morfologické stavby (malého počtu axilárních pupenů). Rozmnožování juvenilních rostlin konifer lze dosáhnout jednak stimulací růstu axilárních pupenů, jednak indukcí adventivních pupenů na kotyledonech, mladých jehlicích a izolovaných pupenech, které jsou pěstovány na živných médiích obsahujících cytokinin .

7. Pletivové kultury • - kalusové • - embriogenní

8. Kalusové kultury - nejstarší in vitro metoda u rostlin a les.dřevin - prvně takto vypěstovaná kultura mrkve ve Fr.- 1930 - dnes se s těmito kulturami pracuje omezeně - nevhodné, že zde probíhají nekontrolovatelné mutace

9. Embriogenní kultury = tzv.somatická embryogeneze vznik v 80.letech indukuje se tvorba somatických embryi - vzniká zvláštní kalus s vnitřní diferenciací pletiv výborně propracováno zejména Nový Zéland, USA, Kanada

10. Nepřímá somatická embriogeneze Proces, při kterém vzniká embrio z jiné buňky než je oplozené vajíčko. Somatická embria často vznikají spíše než z jedné izolované buňky na povrchu explantátu Etapy: 1.) z diferenciovaného pletiva matečné rostliny odebereme embriogenní kalus 2.) na médiu se indikují somatická embria 3.) přenos som. embrií na další médium, kde vyklíčí a dál se vyvíjejí

11. Buněčné kultury Buněčné kultury-jsou využívány zejména v genovém ing. provádí se v tekutých živných médií oproti předešlým princip: v in vitro podmínkách, získáme nediferenc. pletiva,pomocí bioregulačních látek se zpomaluje rozpad pletiv.

12. Obecný princip: mikropropagace

13. Jaký je sled činností? 1.) získání sterilní kultury opláchnutí vodou povrchová desinfekce činidly opláchnutí desinfekce z povrchu vzorků ořezání poškozených pletiv segmentace vzorku 2.) zmnožení kultury Výběr vhodné metody a zmnožení explantátu na připraveném médiu

14. 3.) zakořeňování - IN VITRO často ne zcela funkční kořeny - IN VIVO 4.) převod rostliny do podmínek IN ViTRVO postupná aklimatizace klonů na vnější podmínky hlavně faktor vzdušné vlhkosti a přechod na autotrfní výživu

15. Podmínky: • 1) Výživa – jsou to chem. Def .živná média • složení: nosič,výživné látky • Nosič:přírodní(Agar),synthetický • Výživné látky:makro,mikrobiogenní prvky,Anorg látky(N).Org l.(cukry kyseliny,bioregulační látky Auxiny, stimulátory- • Práškové stimulátory:Výhodou pudrů je jednoduchost jejich požití. Umožňují rychlou aplikaci • Kapalné stimulátory:Auxiny jsou dobře rozpustné v organických rozpouštědlech (aceton, isopropanol, ethanol).

16. 2) Fyzikální podmínky • -Teplo - optimum 20-25, -existují dvě výjimky –chladný režim´=genetická banka(10-15),Termoterapie= krátkodobé vystavení na 40 stupňů při ozdravování • Vlhko - téměř 100%,uzavřené nádoby • Světlo - v temnu se indukuje kalus, na světle probíhají všechny ostatní fáze stand.osvětlení 16 hod.

17. Výhody explantátových kultur: • na malém prostoru se produkuje velký počet rostlin • rychlé (možnost ovlivnit podmínky) • Produkce klonů jejichž množení tradičními metodami probíhá pomalu nebo vůbec • celoroční produkce rostlin • zkrácení šlechtitelského cyklu

18. Nevýhody explantátových kultur: • relativně drahé vybavení laboratoří • pracnost • drahý provoz laboratoře • náročná aklimatizace rostlin na polní podmínky

19. Mikropropagace - ve školkařství

20. Mikropropagace je dnes ve školkařství standardní metodou množení. Využívá skutečnosti, že za jedno vegetační období lze z mikrořízků velikosti 1-2 cm dopěstovat silnou rostlinu v kontejneru P9 se 2-3 výhony schopnou přezimování v našich podmínkách. Výhodou mikrosadby je její velmi nízká cena a malé prostorové nároky ze začátku vegetace (jaro), kdy mnoho školkařských podniků bojuje s nedostatkem místa v temperovaných sklenících. Odpadá také nutnost neekonomického zimování matečných rostlin, které je energeticky a prostorově vysoce náročné.

21. SOUČASNÝ STAV V ČR • V ČR existují výzkumné laboratoře, které se zabývají mnoha aspekty explantátových kultur lesních dřevin in vitro. Jeden ze zakladatelů problematiky explantátových kultur lesních dřevin ve světovém měřítku a zakladatel této problematiky v bývalém Československu a konkrétně laboratoře ve VÚLHM Jíloviště-Strnady Prof. Ing. Vladimír Chalupa, DrSc • Jediným pracovištěm v ČR, které se zabývá pěstováním sadbového materiálu na bázi explantátových kultur in vitro pro lesnickou praxi, je v současné době Laboratoř biotechnologií Olešná Jihočeských lesů České Budějovice, a. s., vedená Ing. Evou Prenerovou

22. Příklad: iniciace prýtu na kaktusových kulturách Na bazální části listu se tvoří kalus

23. Ten je odříznut a pasážován na čerstvé médium a roste a roste. V průběhu čtyř měsíců dospěl do velikosti 50x30x20 mm

24. Po další pasáži je již na povrchu kalusu patrná diferenciace buněk

25. Rozřezání části kalusu a přenesení na čerstvé médium. Tvorba prýtů je už pak velmi rychlá.

26. Kdo mi pomáhal: • Kováč, J.: Explantátové kultury rostlin –nakladatelství University Palackého v Olomouci 1995 • Novák, Fr.: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin- Academia Praha 1990 • Chalupa, Vl.: Zachování genových zdrojů ušlechtilých listnáčů a jejich rozmnožování metodami in vitro, ON-LINE: silvarium.cz

27. konec