Laboratorní postupy testování toxicity průmyslových chemikálií – část I

1. Laboratorní postupy testování toxicity průmyslových chemikálií – část I Průmyslová toxikologie (C867)

2. Posouzení nebezpečnosti PrCHL pro lidské zdraví CÍL • odvodit hodnoty expozice látek, jež by pro člověka neměly být překročeny CESTA • získat informace o nepříznivých (toxických) účincích na zdraví způsobené expozicí látky nebo přípravku. INFORMACE O • toxikokinetice, metabolismu a distribuci • akutních účincích (akutní toxicita, dráždivost a žíravost) • senzibilizaci • toxicitě po opakovaných dávkách • účincích CMR (karcinogenita, mutagenita a toxicita pro reprodukci) • účincích na činnost hormonů

3. Strategie zkoušení - minimalizace počtu zvířat Metody: in silico – modelové systémy na počítači in vitro – pokusy mimo živé tělo (vitrum = zkumavka) ex vivo – pokusy mimo živé tělo in vivo – pokusy v živém organismu Strategie zkoušení v praxi • počítačové modely a databáze = predikce toxicity • alternativní metody in vitro = predikce dávky • nové metody in vivo = mechanismus působení v organismu, na omezeném počtu zvířat s použitím zobrazovací techniky

4. Strategie zkoušení - minimalizace počtu zvířat Replacement = nahrazení: • metody in vitro mimo živý organismus = ALTERNATIVY BEZ POUŽITÍ ZVÍŘAT Reduction = redukce počtu: • in vivo = v živém organismu, na omezeném počtu pokusných zvířat Refinement = zmírnění: • in vivo, ex vivo = živý organismus, upravené metody experimentování Koncepci alternativ k pokusům na zvířatech položili Russel a Burch 1959 v knize „Principy humánní experimentální techniky“. • Alternativy zahrnují všechny postupy, které mohou buď úplně, nahradit pokusy na zvířatech, nebo snižovat počet používaných zvířat, nebo alespoň zmenšovat jejich utrpení v pokusech, které podstupují zvířata proto, aby byly uspokojeny základní potřeby člověka, nebo jiných zvířat“. (Přesná definice Smyth, 1978 Fram, Bals 1983)

5. Toxikologické testování EXPOZICE - ČAS - CESTA Podle času • Akutní jednorázová, krátkodobá • Subakutní opakovaná, 14; 28-denní • Subchronická opakovaná 90-denní • Chronická opakovaná 6; 12; 24 měsíců Podle cesty vstupu do organismu – • Orální – do zažívacího traktu ve vodě; v krmení; sondou • Dermální – na kůži • Inhalační – do respiračního traktu Způsob podání – přiblížit se možné expozici pro člověka !

6. Laboratorní zvířata Konvenční typ zvířat • otevřený chov za dodržení základních hygienických pravidel, • nedefinovaná mikroflóra. SPF (Specificpathogen free) • bariérový chov – přísná hygienická pravidla, • Nesmí být přítomny specifické patogeny pro daná laboratorní zvířata Axenická – Germ-free • chov ve sterilním prostředí v bezmikrobních izolátorech • bez mikroflóry v zažívacím traktu a na povrchu těla Gnotobiotická zvířata • chov ve sterilním prostředí – bezmikróbní izolátory • + velmi dobře definovaná střevní mikroflóra • = očkování specifické mikroflóry axenickým zvířatům

7. Testování na zvířatech - Legislativa ČR Zákon a. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání • přednostně používat alternativní metody. Vyhláška o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat • zajistit standardní podmínky pro experimentální zvířata Nejčastěji používaná laboratorní zvířata • Myš laboratorní • Potkan laboratorní • Morče domácí • Křeček • Králík domácí • Pes domácí • Prase domácí • Ptáci • Ryby

8. Testy na zvířatech – podmínky ve viváriích TEPLOTA • Zachování tepelné rovnováhy, v němž je organismus v klidovém stavu • Myš, Potkan, Morče – 22 + 2 °C, Králík, Pes 18 + 3 °C, Prase, Ovce 17 + 7 °C VLHKOST VZDUCHU • V prostorách pro zvířata je nutná stálá relativní vlhkost cca 55 + 10 %. • Rozmezí 30 – 70% . Jiné po dobu delší než 48 hodin = nepřiměřený stres. SVĚTLO: intenzita, kvalita, • Doporučen světelný režim 12 hodin světlo- 12 hodin tma • Intenzita osvětlení do 200 lx. Pouze při ošetřování 1000 – 1300 lx. • Citlivost u albinotických zvířat. Postupné stmívání vyžadují jen kuřata. • Denní světlo požadují: opice, pes, kočka. Nevhodné pro hlodavce.

9. Testy na zvířatech – podmínky ve viváriích AKLIMATIZACE • před experimentem minimálně 5 dnů po dodání z chovného zařízení VODA • pitná voda (ad libitum), stálá kontrola kvality POTRAVA • standardní peletovaná krmná směs určená pro daný druh zvířete KONTROLA ZDRAVOTNÍHO STAVU • permanentní kontrola = bakteriologické a parazitologické vyšetření určitého vzorku experimentální zvířat KONTROLA PROSTŘEDÍ • monitorování čistoty prostředí ve viváriu – mikrobiologické vyšetření stěrů z chovných nádob a jiného technologického zařízení

10. Akutní toxicita orální – OECD 420, 423, 425 DEFINICE • nepříznivé účinky látky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24h. Strategie testování: 1. in silico 2. in vivo– v současné době není vhodná in vitro metoda TESTOVACÍ METODA • pokusné zvíře – albinotický potkan (3 ks na dávku) • příprava zvířat - odebrání potravy – 24h před testem, vážení • limitní test – výchozí dávka 2000 mg/kg a) negativní výsledek – test ukončen b) úhyn - úplná studie – následné dávky – 300, 50 a 5 mg/kg.

11. Akutní toxicita orální – OECD 420, 423, 425 KLINICKÁ VYŠETŘENÍ • příznaky toxicity – změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevníhooběhu, vegetativního a centrálního nervového systému, motorické aktivity a chování. Pozornost bude věnována také výskytu třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu. MAKROSKOPICKÁ PITVA • u všech zvířat použitých ve studii (uhynulých i utracených). Utracení • bude provedeno vet. přípravkem T 61 inj. ad us vet. (15. den testu). VÝSLEDEK TESTU LD50 ekvivalentních dávek – kategorie • A 50 – 5 mg/kg – velmi toxický • B 300 – 50 mg/kg – toxický • C 300 – 2000 mg/kg – škodlivý • D 2000 – 5000 mg/kg - netoxický

12. Akutní toxicita inhalační – OECD 403 • albinotický potkan - obojí pohlaví • příprava test. látky – příslušná koncentrace v ovzduší • inhalační box – průtok vzduchu, sledování koncentrace v dýchací zóně, měření teploty a vlhkosti • limitní test – nejméně 4 hod expozice, c=20 mg/L plynu, par, aerosolu nebo 5 mg/L pevné látky • toxické účinky nepozorovány - ukončení studie • úhyn – celá studie, expoziční koncentrace – nejméně 3 hladiny (10 zvířat pro jednu dávku 5+5) • pozorování – 14 dní , makroskopická pitva • stanovení LC50 (letální koncentrace = 50% úhyn)

13. Akutní toxicita inhalační – OECD 403 Systém pro inhalační expozici plynům a aerosolům

14. Akutní toxicita dermální – OECD 404 • albinotický potkan - obojí pohlaví • příprava zvířat – holení (24h. před začátkem testování), vážení • aplikace rovnoměrně na plochu asi 10% celkového povrchu těla – látka navlhčena – zajištění dobrého kontaktu s kůží S (mm2) = hmotnost (g) x 0,66 x délka těla (mm) • doba expozice – 24h. – testovaná látka je fixována pomocí mulového obvazu a nedráždivé náplasti – zabránění orálnímu příjmu • ukončení aplikace – zbytky odstraněny omytím vodou • pozorování – 14 dní , makroskopická pitva

15. Testy kožní dráždivosti a leptavosti DEFINICE • stanovení dráždivých/leptavých účinků po jednorázovém nanesení testované látky na kůži. Strategie testování: 1. In silico + pH testované látky 2. In vitro – modely lidské kůže EpiDerm, EPISKIN 3. In vivo – pokusné zvíře albinotický králík

16. Testy kožní dráždivosti a leptavosti In-vitro – Modely lidské kůže EpiDerm a Episkin Princip: • trojrozměrný model lidské kůže - rekonstruované epidermis s funkční stratum corneum • účinek testované látky na životnost buněk • cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy Provedení: • testovaná látka je umístěny na stratum corneum epidermálního modelu ve 2 epozičních časech. Expozice je ukončena omytím fosfátovým pufrem. Poté jsou tkáně inkubovány s MTT (žlutá tetrazoliová sůl). Pokud jsou buňky živé, MTT je v mitochondriích redukován sukcinát dehydrogenázou na modrý formazanový precipitát. Ten je přes noc z buněk vyextrahován okyseleným izopropanolem a kvantifikován spektrofotometricky. Použití: • testy leptavých účinků na modelech lidské kůže jsou schopny rozlišit dráždivé a leptavé účinky.

17. Testy kožní dráždivosti a leptavosti EPISKIN MTT Formazan

18. Testy kožní dráždivosti a leptavosti Pozorovaná barevná změna při in-vitro testu na kožním modelu Episkin

19. Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na kůži - OECD 404 • In vivo test nelze použít pro látky s pH menším než 2 a vyšší než 11,5 TESTOVACÍ METODA • pokusné zvířa – albinotický králík plemene Novozélandský bílý bez rozlišení pohlaví - dávka – 0,5 ml nebo 0,5 g (zaleží na skupenství) - před aplikací oholení kůže ve hřbetní krajině, vážení zvířete • aplikace testované látky (6cm²) - fixace pomocí mulového obvazu a nedráždivé náplasti (u pevných testovaných látek – smočení vodou – lepší kontakt s kůží)

20. Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na kůži - OECD 404 Počáteční zkouška – 1 zvíře – expozice: 3 min., 1h., 4h. Potvrzující zkouška - 2 zvířata - expozice: 4h. • pozorování - stupeň podráždění kůže - příznaky erytému a edému za 1 hod, 24, 48, 72 hodin a dále pokud je nutné 1x denně po dobu 14 dnů • jiné toxické účinky (pitva jen v závažných případech toxicity) HODNOCENÍ VÝSLEDKU TESTU • stupeň podráždění kůže, vratnost či nevratnost kožních lézí

21. Testy oční dráždivosti a leptavosti DEFINICE • stanovení dráždivých a leptavých účinků na oči po jednorázové aplikaci testované látky do oka Strategie testování: 1. In silico 2. In vitro – modely EpiOcular 3. Ex vivo – metoda BCOP – test na hovězí rohovce 4. In vivo – pokusné zvíře - albinotický králík

22. Testy oční dráždivosti a leptavosti In-vitro – Modely lidské kůže EpiOcular Princip testu: • trojrozměrný model umělé tkáně EpiOcularTM z lidských keratinocytů kultivovaných do podoby vrstevnatého dlaždicovitého epitelu podobného lidské rohovce • zjišťuje se účinek látky na životnost buněk, cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy Provedení: • testovaná látka je umístěna na povrch modelu ve 3 expozičních časech • inkubace v 37°C, 5%CO2 inkubátoru v intervalech – 3 min., 30 min., a 60 min) • do testu vloženy i tkáně inkubované s pozitivní (Triton X-100) a negativní kontrolou (destilovaná voda)

23. Testy oční dráždivosti a leptavosti Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437 • BCOP je alternativní metoda pro testování oční dráždivosti/žíravosti in-vitro. Účelem zavedení BCOP testovací metody je snaha o redukci množství použitých laboratorních zvířat (králíků) nahrazením jiným testovacím systémem, tj. použití tkání z poraženého hovězího dobytka (ex-vivo). • Míra poškození rohovky způsobeného testovanou látkou je vyjádřena kvantitativně IVIS (in vitro irritancyscore) pomocí něhož je přiřazena kategorie dráždivosti pro odhad in-vivo očního dráždivého potenciálu testované látky.

24. Testy oční dráždivosti a leptavosti Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437 • Rohovky bez defektů jsou odříznuty (2 až 3 mm prstenec bělimy). Izolované rohovky jsou umístěny do speciálně navržených držáků. Držáky jsou naplněny mediem (EMEM).

25. Testy oční dráždivosti a leptavosti Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437 Opacita: • množství světla prošlého rohovkou (opacitometr), průměrná hodnota opacity Permeabilita: • množství fluoresceinu sodného, které proniklo všemi buněčnými vrstvami rohovky. Roztok fluoresceinu (4[l] nebo 5[s] mg/ml) je přidán do přední komory držáku (epithelialní strana rohovky). Koncentrace fluoresceinu, která pronikla do zadní komory (endoteliální strana rohovky) je měřena pomocí UV/VIS spektrofotometru při 490 nm

26. Testy oční dráždivosti a leptavosti Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437 průměrná hodnota permeability OD490 - IVIS (in vitro irritancy score) IVIS = průměrná hodnota opacity + (15x průměrná hodnota permeability OD490 ) IVIS Klasifikace ≥55,1 Dráždivé nebo žíravé

27. Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405 In vivo test TEST JE PROVÁDĚN V NÁVAZNOSTI NA TEST DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI provedení testu je možné jen při znalosti účinků testované látky na kůži pozitivní test na kůži – předpoklad pozitivního účinku i na oko (oko citlivější) – netestuje se na zvířatech

28. Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405 In vivo test TESTOVACÍ METODA • pokusné zvířa – albinotický králík plemene Novozélandský bílý bez rozlišení pohlaví • 24 hodin před aplikací vyšetření obou očí, vážení zvířete • dávka – 0,1 ml nebo 0,1 g (zaleží na skupenství) • aplikace testovaného materiálu do spojivkového vaku levého oka (pravé oko – kontrola) Počáteční zkouška – 1 zvíře Potvrzující zkouška - 2 zvířata

29. Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405 In vivo test TESTOVACÍ METODA • výplach – 24h. po aplikaci testovaného materiálu • pozorování • oči se vyšetřují po 1, 24, 48 a 72 hodinách • oční léze – intenzita (rohovka, duhovka, mžurka, spojivka), • vratnost nebo nevratnost změn (pozorování až 21 dní) • jiné projevy toxicity (denně) HODNOCENÍ VÝSLEDKU TESTU • stupeň vzniku očních lézí na rohovce, duhovce, mžurce, spojivce