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Techniques immunologiques

Techniques immunologiques. Plan du cours. A) Propriétés du complexe anticorps/antigène. Immunodiffusion. Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse. Immunodétection. "Ag" ou d'anticorps soluble: ELISA et Westernblot. "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux (Facs). IgE: RIST et RAST.

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Presentation Transcript

  1. Techniques immunologiques Plan du cours A) Propriétés du complexe anticorps/antigène Immunodiffusion Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble: ELISA et Westernblot "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux (Facs) IgE: RIST et RAST Détection de complexes immuns: test au C1q B) Propriétés du complément CH50 C) Réponses lymphocytaires Test de lymphoprolifération aux mitogènes Test de culture mixte

  2. A) anticorps/antigène Immunodiffusion anticorps + antigène +++ anticorps++ antigène ++ anticorps+++ antigène + équivalence Ac polyclonal Ac monoclonal Précipitation

  3. A) anticorps/antigène Immunodiffusion anticorps+antigène précipitation Visalisation sur gel (bleu de comassie) Ouchterlony Immunoélectophorèse

  4. Ouchterlony Sensibilité: 20-200µg/ml Équivalence: précipité bleu

  5. Ouchterlony • Intérêt surtout historique (savoir que c’est une technique basée sur la diffusion et la précipitation mais les détails ne sont pas matière d’examen) • Permet la comparaison directe de différents antigènes (par exemple les déterminants antigéniques de l’albumine de deux espèces voisines sont-ils différents ou partiellement semblables?)

  6. Ouchterlony • Un puits central dans lequel on introduit les anticorps (aussi appelés antisérum) • Des puits périphériques équidistants dans lesquels on introduit les antigènes à évaluer • Si une seule protéine (ou un seul polysaccharide) est reconnu par l’antisérum : 1 bande; si deux protéines de PM différents sont reconnues : 2 bandes • La bande la plus proche du puits central correspond à l’antigène qui a migré le plus vite (qui est donc le plus petit)

  7. Ouchterlony • Si on dépose des préparation différentes dans les puits périphériques, on compare les courbes de précipitation en regard de chaque puits périphérique • Lorsqu’on dépose la même protéine (ou le même polysaccharide) dans deux puits adjacents, les traits de précipitation vont se rejoindre : c’est la réaction d’identité

  8. Ouchterlony • Si deux protéines (ou polysaccharides) différents mais partageant un déterminant antigénique sont introduites dans deux puits périphériques adjacents, les traits de précipitation fusionnent mais on note une projection qui prolonge le précipité formé par la réaction principale : cette projection est due à des anticorps qui reconnaissent des déterminants antigéniques qui ne sont pas présents dans les deux solutions : c’est la réaction d’identité partielle

  9. Quizz:Ouchterlony - F(ab) - k chains - l chains - Fc from IgG with k chains - A mixture of gheavy and k chains -g chains

  10. Réponses au Quizz (just for the fun) 1 Fab : identité partielle avec 2 2. Chaînes g Identité avec ligne externe de 3 3. Mélange de chaînes g et de chaînes légères k deux bandes distinctes car les protéines ont des PM différents et ne diffusent pas de la même façon La ligne la plus proche du puits central : k (identité avec 4) L’autre ligne : la protéine la plus lourde g 4. Chaînes k Absence d’identité avec 5 Réaction d’identité avec une des protéines 3 5. Chaînes l Reconnaissance mais absence d’identité avec 4 6. Portion Fc d’une IgG possédant des chaînes k Aucune reconnaissance (pas de bande)

  11. Quizz: Ouchterlony

  12. A) anticorps/antigène Immunodiffusion Immunoélectrophorèse Mélange d'antigènes trop complexe (beaucoup de molécules de poids moléculaires très voisins) Séparation des Ag selon leur charge avant d’être détecter par précipitation

  13. Immunoélectrophorèse Puits contenant la mixture d'Ag Déplacement des ≠ Ag Diffusion des Ac Technique qualitative peu sensible (>100µg/ml)

  14. Immunoélectrophorèse Utilisation: Sérum (IEP-sérum) ou urine (IEP-urine) Immunoglobulines Albumine Transferrine Détection Immunoglobulines Détection d’immunodéficience: faible quantité d’un ou plusieurs isotypes Polyclonal ou monoclonal

  15. A) anticorps/antigène Immunodétection IgM IgG Radioactif Enzyme/Chromogène Fluorescence

  16. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble ELISA Westernblot Sérum Urine Surnageant de culture Etc.

  17. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay Enzyme/Chromogène

  18. ELISA Exemple: détection d'Ac anti-HIV Résultat Sensibilité: 10-1000 pg/ml

  19. ELISA Détection Ac ELISA sandwich Détection Ag Ac de capture

  20. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble Westernblot Séparation des ≠ Ag par électrophorèse sur gel Détection par Ac (présent dans le sérum du patient) Détection de Ac par un Ac marqué Exemple: détection des faux positifs HIV (détecté par Elisa)

  21. Westernblot Exemple: détection d'Ac anti-HIV Résultat Protéines HIV Patient A: négatif Patient B: indéterminé Patient C: positif Pos Neg patients

  22. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux Immunohistochimie Cytométrie en flux (FACS)

  23. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Principe indirecte directe

  24. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: marquage actine, tubuline et noyau

  25. Maladie de Goodpasture (dépôts linéaires d’IgG et de C3b)

  26. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: infiltration CD4 dans une tumeur Nég Pos

  27. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: marquage Fas Nég Pos

  28. A) anticorps/antigène Immunodétection Présence d'anticorps "anti-soi" Anticorps anti-nucléaire Sérum patient Cellules test

  29. A) anticorps/antigène Immunodétection Présence d'anticorps "anti-soi" Anticorps anti-nucléaire

  30. A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules en flux Cytométrie en flux FACS = fluorescence activated cell sorter

  31. A) anticorps/antigène Immunodétection Cytométrie en flux (FACS) Principe directe indirecte

  32. FACS 3000 cellules/sec

  33. FACS Sang "granulosité" Taille

  34. FACS Sang Th Fluorescence orange Tc Fluorescence verte

  35. Avantages et inconvénients Facs versus coupe FACS: Rapidité d'analyse Multi-couleurs Possibilité de tri Coupe: Localisation Interaction entre ≠ cellules

  36. A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RIST et RAST Atopie

  37. A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RIST RIST = radioimmunosorbent test quantification des IgE totales

  38. A) anticorps/antigène Immunodétection RIST = quantification des IgE totales

  39. A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RAST RAST = radioallergesorbent test quantification des IgE spécifiques

  40. A) anticorps/antigène Immunodétection RAST = quantification des IgE spécifiques

  41. A) anticorps/antigène Immunodétection Test au C1q Le complexe C1

  42. La liaison de C1q à deux Ig ou plus n’est possible que si ces dernières appartiennent à un même complexe immun ou si elles sont fixées sur une même surface

  43. A) anticorps/antigène Immunodétection Test au C1q C1q Ac libre Complexe immun

  44. B) Propriétés du complément CH50 Mesure l'activité fonctionnelle du complément

  45. Voie lectine Voie classique C1, C4, C2 Voie alterne P, C3, B, D complément C3 Amplification P, B, D C3b Lyse de la cellule cible C5-C9

  46. Complément Sérum patient Globule rouge sensibilisé par Ac Destruction du globule rouge B) Propriétés du complément CH50

  47. Sérum patient Complément B) Propriétés du complément CH50 Quantification: quantité de sérum nécessaire pour lyser 50% des globules rouges

  48. B) Propriétés du complément CH50 Sérum patient Complément Quelle(s) protéine(s) du complément est (sont) absente(s) ou non fonctionnelle(s)?

  49. B) Propriétés du complément C3

  50. C) Réponses lymphocytaires Test de lymphoprolifération aux mitogènes Test de culture mixte (MLR)

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