Chapitre 6 Techniques de purification des protéines Isolement des protéines A. Choix d’une source de protéines B. Tech

1. Chapitre6Techniques de purification des protéines Isolement des protéines A. Choix d’une source de protéines B. Techniques de solubilisation C. Stabilisation des protéines D. Détection des protéines E. Stratégie générale de purification de protéines

2. 2. Solubilité des protéines A. Influence de la concentration en sels B. Influence du pH 3. Separation par chromatographie A. Chromatographie par échange d’ions B. Chromatographie par filtration sur gel C. Chromatographie d’affinité D. Autres techniques chromatographiques

3. 4. Electrophorèse A. SDS-PAGE B. Focalisation isoélectrique 5. Ultracentrifugation A. Ultracentrifugation préparative

4. Purification des protéines Pourquoi purifier ? Etudier les propriétés d’une protéine Déterminer sa séquence en acides aminés Déterminer sa structure tridimensionnelle Difficulté Les cellules contiennent généralement plus de 1000 types de protéines différentes. Chaque protéine a donc en moyenne une abondance inférieure à 1/1000 Solution Tirer profit des différences de propriétés physicochimiques et biochimiques des protéines: solubilité, taille, point isoélectrique, charge, hydrophobicité, affinité pour certains ligands

5. Ces techniques sont des outils de base de la biochimie et et beaucoup de ces techniques sont utilisées en routine pour des applications cliniques 1 ISOLEMENT DES PROTEINES Certaines protéines représentent la substance principale d’une cellule, par exemple l’hémoglobine dans les globules rouges. D’autres protéines, comme le répresseur de l’opéron lactose d’E. coli, se trouvent qu’à raison de quelques molécules par cellule. Les mêmes techniques sont utilisées pour purifier ces deux protéines. Leur isolement et leur purification représentent souvent des jours de travail pour obtenir quelques milligrams (mg) ou micrograms (g) de la protéine désirée

6. A. Choix d’une source de protéines Les protéines qui assurent des fonctions identiques se retrouvent en général chez de nombreux organismes, par exemple les enzymes de la glycolyse Mais, on peut trouver différentes variantes d’une même protéine dans différents tissus du même organisme ou dans différents compartiments de la même cellule, par exemple des isozymes Le choix doit tenir compte de critères tels que: possibilité de se procurer facilement des quantités suffisantes du tissu d’ou on veut isoler la protéine On utilise souvent des tissus d’animaux tels que poulets, boeufs, porcs ou rats. On peut également partir de microorganismes comme E. coli ou la levure

7. A. Choix d’une source de protéines.... Par clonage moléculaire, pratiquement n’importe quel gène codant une protéine peut être isolé de son organisme d’origine et exprimé en grande quantité (surexprimé) dans un organisme approprié mis en culture tel que E. coli ou la levure La protéine ainsi clonée et surexprimé peut représenter jusqu’à 30% des protéines totales de la cellule surproductrice Ceci facilite beaucoup l’isolement et purification de la protéine clonée

8. B. Techniques de solubilisation La méthode de lyse la plus simple appelé lyse osmotique, consiste à mettre les cellules dans un milieu hypotonique. Pour faciliter la rupture de cellules, on ajoute souvent un détergent non ionique comme le Triton ou le Tween Cette technique est sans effet avec les cellules qui ont une paroi cellulaire. Le lysozyme peut être utilisé pour digérer les parois bactériennes Dans beaucoup de cas, un traitement mécanique est nécessaire: broyage en présence de sable, l’utilisation d’un homogénéiseur, d’une Presse de French ou d’un sonicateur. Le lysat obtenu est ensuite centrifugé

9. Centrifugation différentielle

10. C. Stabilisation des protéines Les protéines sont facilement dénaturées à haute température et se dénaturent lentement à 25°C. La purification de protéines se fait normalement à 4°C Les cellules contiennent des protéases qu’on peut inactiver ou inhiber par des agents chimiques spécifiques D’autres précautions: éviter l’oxydation de résidus cystéines; éviter la contamination par des métaux lourds; garder la concentration saline dans la zone de stabilité de la protéine; empêcher la croissance des micro-organismes; éviter de faire mousser et garder une solution protéique sous forme concentrée

11. D. Détection des protéines Lorsqu’on purifie une protéine, on doit pouvoir la mesurer quantitativement et spécifiquement. En conséquence, on doit disposer d’une méthode de dosage spécifique a. Les dosages de protéines les plus simples s’appliquent aux enzymes - dosage spectrophotométrique, fluorométrique ou radiochimique b. On peut détecter des protéines autres que des enzymes en tirant parti de leur propriété de se lier à des molécules spécifiques (ligands) par exemple des récepteurs

12. c. Les techniques immunochimiques sont très sensible et spécifiques. Ces méthodes utilisent des anticorps produites par le système immunitaire d’un animal en réponse à l’injection d’une protéine étrangère (anticorps polyclonaux) On peut également obtenir des anticorps monoclonaux en fusionnant une cellule produisant l’anticorps avec une cellule d’un cancer du système immunitaire appelé myélome On détecte la protéine directement en la faisant précipiter avec ces anticorps ou indirectement par dosage immunoenzymatique appelé ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay)

13. Anticorps secondaire Enzyme Produit coloré Anticorps primaire Test immunoenzymatique (ELISA) Substrate Echantillon contenant différents antigens

14. E.Stratégie générale de purificationdes protéines • Leurs différentes propriétés physicochimiques et biochimiques • sont mises à profit • Charactéristiques Techniques • Solubilité 1. Solubilisation/précipitation saline • Charge ionique 1. Chromatographie par échange d’ions • 2. Electrophorèse • 3. Focalisation isoélectrique • Caractère polaire 1. Chromatographie d’adsorption • 2. Chromatographie en phase inverse • 3. Chromatographie par interactions • hydrophobes

15. E.Stratégie générale de purificationdes protéines • Leurs différentes propriétés physicochimiques et biochimiques • sont mises à profit • Charactéristiques Techniques • Taille moléculaire 1. Dialyse et ultrafiltration • 2. Electrophorèse en gel • 3. Chromatographie par filtration sur • gel • Spécificité de liaison 1. Chromatographie d’affinité

16. 2 SOLUBILITE DES PROTEINES A. Influence de la concentration en sels La solubilité d’une protéine à faible force ionique augmente généralement avec la concentration en sel, appelé ‘’salting in’’ (solubilisation saline) Pour des forces ioniques élevées, la solubilité des protéines diminue, appelé ‘’salting out’’ (précipitation saline)

18. B. Influence du pH La solubilité d’une protéine est au minimum quand pH = pI. Cette propriété est l’origine d’une méthode de purification des protéines appeléprécipitation isoélectrique

20. 3 SEPARATION PAR CHROMATOGRAPHIE La solution de protéines dissout dans la phase mobile est filtrée à travers d’une colonne constituée d’un support solide poreux: la phase stationnaire Les interactions des différentes protéines avec la phase stationnaire ralentissent plus ou moins leur migration à travers le support Si la force de rétention est de nature ionique, la technique de séparation est appelée chromatographie par échange d’ions

21. A. Chromatographie par échange d’ions Dans le processus d’échange d’ions, les ions liés électrostatiquement à un support insoluble et chimiquement inerte sont remplacés de manière réversible par des ions en solution: Résine+A- + Protéine- Résine+Protéine- + A-

22. Chromatographie sur échangeurs d’anions Principe : une protéine a - une charge positive aux pH < pI - une charge négative aux pH > pI Elle peut donc être retenue sur un échangeur de cations ou un échangeur d’anions, suivant le cas Elle peut alors être éluée par passage d’un tampon contenant du sel en quantités croissantes Echangeur d’anions = gel porteur de charges fixes positives Echangeur de cations = gel porteur de charges fixes négatives

23. Chromatographie d’échanges d’ions avec élution par paliers

24. Dispositif pour créer un gradient de concentration linéaire

25. B. Chromatographie par filtration sur gel Dans la chromatographie par filtration sur gel, appelée également chromatographie par exclusion ou par tamisage moléculaire, les protéines sont séparées selon leur taille et leur forme a. La plupart des gels sont constitués de dextran (Sephadex), d’agarose ou de polyacrylamide La filtration sur gel est souvent utilisée pour ‘’dessaler’’ une solution protéique. Ainsi, on peut éliminer le sulfate d’ammonium d’une protéine qui a été précipitée par ce sel

26. Chromatographie par filtration sur gel

27. b. La chromatographie par filtration sur gel peut servir à estimer les masses moléculaires

28. c. La dialyse est une forme de filtration moléculaire La dialyse permet de séparer les molécules selon leur taille, en utilisant des membranes semiperméables dont les pores ont une taille inférieure aux macromolécules

29. C. Chromatographie d’affinité Dans la chromatographie d’affinité, un ligand qui se lie spécifiquement à la protéine est fixé par covalence à une matrice inerte et poreuse Quand une solution protéique traverse ce matériel, la protéine d’intérêt se lie au ligand immobilisé, tandis que les autres sortent de la colonne. On peut récupérer la protéine désirée sous forme très pure en modifiant les conditions d’élution de sorte que la protéine se détache de la matrice chromatographique

30. Chromatographie d’affinité Principe : Repose sur la relative spécificité d’interaction d’une protéine pour certains ligands Exemple : affinité de l’hexokinase pour l’ATP La protéine s’adsorbe sur un gel sur lequel le ligand est fixé de façon covalente Elle est ensuite éluée en lavant avec un milieu contenant du ligand non fixé (ou en augmentant la concentration en sels, ou en changeant le pH)

31. . Ligand fixé à la matrice Protéine ayant de l’affinité pour le ligand Autres protéines

32. Purification de la nucléase de staphylocoque par chromatographie d’affinité -le compose représenté en (b) a été lie par covalence à de l’agarose activé par le CNBr

33. D. Autres techniques chromatographiques a. La chromatographie en phase inverse (RPC) Dans les protéines dénaturées, les chaînes latérales non polaires se trouvent exposées au solvant. Par conséquent, les protéines établissent des interactions hydrophobes avec les groupes non polaires fixés sur une matrice Les protéines sont éluées par une phase mobile contenant une forte concentration de solvant organique tel que l’acétonitrile Dans la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse, des chaînes paraffiniques sont fixées sur des billes de silice

34. b. La chromatographie par interactions hydrophobes sépare les protéines natives en vertu de l’hydrophobicité de surface Principe : Les protéines présentent des affinités variables pour les groupements hydrophobes Elles se lient donc avec une affinité variable à un gel porteur de groupements hydrophobes Elles peuvent en être éluées, soit en diminuant la concentration de sels, soit en augmentant la concentration d’un solvant moins polaire que l’eau (éthylène glycol)

35. 4 ELECTROPHORESE • Séparation de solutés chargés par migration dans un champ électrique • - la migration dépend: • de la charge de la protéine • de sa taille • du support (gel plus ou moins réticulé, papier) • dans la focalisation isoélectrique (électrophorèse dans gradient de pH) • migration dépend uniquement du pI • dans l’électrophorèse “SDS-PAGE”*, la vitesse de migration dépend • de la taille de sous-unité (protéine dénaturée) • - du degré de réticulation du gel • * Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

36. A. SDS-PAGE Le SDS se lie très fortement aux protéines en leur conférant une forme de bâtonnet. Les protéines lient environ une molécule de SDS pour deux résidus d’acides aminés La forte charge négative apportée par le SDS masque la charge intrinsèque de la protéine, bien que le rapport e/m reste identique. Par conséquent, l’électrophorèse de protéines en gel de polyacrylamide contenant du SDS les sépare en fonction de leur masse moléculaire, par effect de filtration sur gel: SDS-PAGE

38. SDS-PAGE

40. Relation logarithmique entre la masse moléculaire d’une protéine et sa mobilité électrophorétique relative en SDS-PAGE

41. “Western blot” = “immunoempreinte” Révélation d’une protéine à l’aide d’un anticorps spécifique

42. B. Focalisation isoélectrique Si un mélange de protéines est soumis à une électrophorèse dans une matrice ayant un gradient de pH et dont le pH augmente lentement de l’anode vers la cathode, chaque protéine va migrer jusqu’à l’endroit où le pH est égal à son point isoélectrique:

43. Electrophorèse sur gel en deux dimensions (électrophorèse 2D)

44. Le gradient de pH est obtenu en mélangeant des oligomères de faible mass (300-600 Da) qui portent des groupes amino et carboxyliques aliphatiques (ampholytes) formant ainsi un éventail de points isoélectriques

45. 5 ULTRACENTRIFUGATION L’ultracentrifugeuse, mis au point par The Svedberg en 1923, peut atteindre des vitesses de rotation de 80000 rpm et permet la sédimentation de macromolécules. La masse d’une particule peut être calculée à partir de son coefficient de sédimentation, analogue à la mobilité électrophorétique, en unités Svedberg (S)

46. A. Ultracentrifugation préparative Dans l'ultracentrifugation zonale, une suspension protéique est soigneusement déposée au-dessus d'un gradient de densité de saccharose. Au cours de la centrifugation, chaque particule traverse le gradient en fonction de son coefficient de sédimentation: Ultracentrifugation zonale -utilisé pour des complexes macromoléculaires, des particules et des fractions membranaires