Regulace mitosy a replikace DNA

1. Regulace mitosy a replikace DNA a její souvislost s degradací cyklinů (ponenáhlu se dotýkáme výstupů) vstupy výstupy velikost signály poškození ... gen. exprese morfogeneze ...

2. (B. Němec, 1900?)

3. Co vlastně dělá „MPF“? Naivní model: MPF G2/metafáze MPF metafáze/anafáze ... ale je to složitější!

4. Standardní mitosa (živočišné buňky) metafáze profáze anafáze B anafáze A telofáze

5. Pučivá kvasinka – co poznáme? AnaB/Telo S Meta/AnaA

7. Rostlinnou mitosu lze chápat jako variaci

8. spindle cortical array preprophase band fragmoplast

9. ... ale najdou se i zajímavější (Dinoflagellata!) Ceratium sp. („permanentně kondenzované chromozómy“)

10. Jaderná membrána přetrvává, chromozómy stále „kondenzovány“ a vázány k ní, vřeténko „vně“ ... Tedy: co následuje, nemusí být univerzální (možná ani u Opisthokont!)

11. Úloha CDK-cyklinových komplexů: co je třeba pro vstup do mitosy (G2/M)? • Aktivace CDK vazbou „mitotických cyklinů“ (CLB, CycA/B), tedy degradace CKI a cyklinů předchozí vlny • Aktivace CDK fosforylací T161 • Dereprese CDK defosforylací T14, Y15 Jak jsou kontrolovány další kroky ... a jak se oddělují chromatidy?

12. Rekapitulace: • Obnova CLN kinázy stabilizuje CLB. • Model!

13. Mají „cyklové hodiny“ trojtaktní motor? (CKI) none CLN CLB

14. Co je „destruction machinery“? ... opět proteasom + E2/E3!

15. Alternativní E3: APC – anaphase promoting complex (Cdc4) F S C (Cdc53)

16. Další role APC: separace chromosomů Sesterské chromatidy drží pohromadě kohesinové komplexy. SMC (structural maintenance of chromosomes) SCC (sister chromatid cohesion) místo proteolyt. štěpení (C. H. Haering)

18. Dekoheze: • Fosforylace kohesinů – kinázy skupiny Polo (Plk), Aurora • Štěpení zbylých zprostředkováno APC!!

19. Shugoshin: ochrana centromeric. kohesinů?

20. Mitosa vs. meioze • meiotické kohesiny (vydrží Ana I, lépe stabilizovány Shugoshinem?) • variantní proteinové komplexy centromer (monopolární přichycení k vřeténku)

21. Amatomie APC/cyklosomu (cyclosome) • Podjednotky: Cdc16, Cdc23, Cdc26, Cdc27, BimE + 3 další • Regulace: Cdc20 nebo Cdh1 • Cdc20 sám degradován via APC • Cdh1 je substrátem CDK (inaktivační P ace!) mND fenotyp

22. APC i regulátory lze najít i u rostlin Tarayre et al. 2004

23. Aktivace APC – zjednodušeně: Polo, Cdc5, Aurora etc. (kinázy)

24. Regulace APC pomocí CDK, Cdc20 a Cdh1 mitotic CDK APC Cdc20 Polo, Cdc5, Aurora etc. P APC (active) APC (inactive) autoinhibice APCCdc20 P Cdh1 mitotic CDK Cdh1 P APC (active) mitotic CDK APCCdh1

25. Jaký to má smysl?? Cdc20 anafáze P APC (active) APC (inactive) P Cdh1 telofáze/G1 mitotic CDK Cdh1 P APC (active)

26. Co přepíná mezi oběma mody? Cdc14 protein fosfatáza!(fenotyp jako Cdc15) APC (inactive) Cdc14 P Cdh1 mitotic CDK Cdh1 P APC (active)

27. Mitotic exit network (MEN) a role Cdc14, Cdc15 ... • CDC14: dual specifity protein phosphatase. • až do anafáze inaktivní, v jadérku, vázána na inhibitor Cfi1/Net1 • uvolnění fosforylací inhibitoru GEF GAP GTPáza kináza kináza fosfatáza

29. Fourteen Early Anaphase Release (FEAR) network. • Role v přechodné aktivaci Cdc14 v časné anafázi • zahrnuje opět Polo kinázy

31. P.S.: co degraduje CLN?

32. Replikace DNA a její regulace

33. Regulace replikace spřažena s transkripcí! (histony, RNR etc.) ... což není překvapující (předn. 4)

34. Klíčovou úlohu mají replikační počátky. Proč se počátky replikují právě jednou za cyklus?

35. ARS versus počátek replikace in vivo autonomous replicating sequence Přímá vizualizace: DNA combing (Lebofsky and Bensimon 2002)

36. ... ale jde to i méně sofistikovaně • - EtBr • + EtBr (Fangman et al.)

37. Každý ORI má své cykliny Model of the Ability of B-Type Cyclins to Promote S Phase and Activate Replication Origins(A), (B), and (C) show time lines (not to scale) representing the cell cycle in CLB, clb5, and clb5 clb6 strains, respectively. Arrows indicate the time of bud emergence during the cell cycle, and the duration of S phase in each case is drawn as an open box. Firing of the various replication origins is shown by shaded circles. Light shading represents origins activated early in S phase, and darker shading those origins activated later. Hatched bars represent the proposed capability of different Clb-Cdk1p activities to promote timely firing of early and late replication origins. (Donaldson et al. 1998)

38. M S Trvání eukaryotního BC - příklady • Saccharomyces - v bohatém médiu 1,5-2 h • Drosophila: 6 min až 10 hod M M G1 S G2 G2 S 6 min 10 h ... zde používány specifické embryonální ORI!

39. Replikační počátek váže řadu proteinů (DePamphilis 2003)

40. Cdc6 (S. cer.), cdc18+ (S.p.) ... a exprese je regulovaná (S. Piatti et al.)

41. Haploidní mitosa v buňkách bez Cdc6

42. Chromosomy se rozcházejí náhodně! (Piatti et al., EMBO J. 1995)

43. Je Cdc6 „licensing factor“? (Rao and Johnson)

44. Cdc6 jakožto transientní „licensing factor“

45. Je Cdc6 jedinou překážkou rereplikace? APC??? (Piatti et al. 1997)

46. Ale to, co se rereplikuje, není jaderná DNA! Pozor na interpretaci, a na mitochondrie!!

47. Kontrola replikace: 2 stavy ORC APC CLB-CDK anafáze Cdc6, Mcm S-fáze CLB-CDK Sic1 Cdc34 prereplikační CLN-CDK postreplikační