1 / 43

Współczesne metody analiz genetycznych

Współczesne metody analiz genetycznych . Anna Jakubowska. Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM. Genom. Chromosom. Gen. Gen. Region międzygenowy. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_genome_to_genes.png. Poznanie genomu człowieka.

corby
Download Presentation

Współczesne metody analiz genetycznych

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Współczesne metody analiz genetycznych Anna Jakubowska Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM

  2. Genom Chromosom Gen Gen Region międzygenowy http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_genome_to_genes.png

  3. Poznanie genomu człowieka • rozpoczęcie HGP – 1990 (Human Genome Project) • wstępny opis sekwencji – 2000 (Venter et al., Science 2001; Lander et al., Nature 2001) • zakończenie sekwencjonowania – 2003 • oficjalne zakończenie HGP – 2004 (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 2004 )

  4. Struktura genomu człowieka • 3 274 571 503 pz • ~ 2% to sekwencje kodujące • 21 911 genów kodujących białka • 8 483 genów kodujących RNA • 12 599 pseudogenów • ~ 98% to sekwencje niekodujące • introny oraz sekwencje międzygenowe • 23 326 320 SNPs(polimorfizmy pojedynczego nukleotydu) • ~ 8 400 regionów CNV (duplikacje lub delecje odcinków DNA o długości >500 zasad) (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable)

  5. Geny • funkcja wielu genów wciąż niepoznana • identyfikacja genów lub specyficznych stref genetycznych związanych z rozwojem chorób: • badania asocjacyjne • sekwencjonowanie genomu

  6. Badania asocjacyjne • analiza wybranych markerów –kandydatów • analiza markerów pokrywających cały genom, tzw. GWAS (Genome – Wide Association Study) potocznie nazywana skanowaniem genomu

  7. GWAS Badanie „przypadek - kontrola” („case - control”), w którym analizuje się związek pomiędzy występowaniem określonej cechy klinicznej a SNPs lub CNVs rozmieszczonymi w całym genomie C A B A B B B C A C SNP CNV http://www.snipscreen.com/genetics.php

  8. Założenia GWAS • badanie dużej liczby polimorfizmów o największej zmienności międzyosobniczej • badanie jak największej grupy osób chorych i zdrowych

  9. Chorzy Zdrowi DNA DNA Porównanie Identyfikacja SNP związanych z chorobą http://cpmc.coriell.org/Sections/Medical/GeneInteraction_mp.aspx?PgId=93

  10. Badania GWAS – kluczowe zasady • homogenność grupy badanej pod względem analizowanej cechy • liczna grupa kontrolna oraz badana • walidacja

  11. Etapy GWAS Badane SNPs Przypadki i kontrole I etap II etap III etap Mapowanie zmian Analiza funkcjonalna Garcia-Closas M , Chanock S Clin Cancer Res 2008;14:8000-8009 http://clincancerres.aacrjournals.org/content/14/24/8000/F3.expansion.html ©2008 by American Association for Cancer Research

  12. Polimorfizmy dla GWAS • wysoka częstość, MAF (minor allele frequency) >5% • ~7 mln SNP o częstości MAF >5% • ~4 mln SNP o częstości 1-5% • brak sprzężenia SNP nie powinny znajdować się w genomie blisko siebie w tzw. nierównowadze sprzężeń (linkage disequilibrium) • wykorzystanie mikromacierzy • Affymetrix • Illumina

  13. Projekt HapMap • międzynarodowe przedsięwzięcie obejmujące Japonię, Kanadę, Chiny, Nigerię i USA w celu identyfikacji oraz określenia częstości zmian polimorficznych w genomie ludzkim w różnych populacjach • 270 osób: • 90 z Nigerii • 45 z Japonii • 45 z Chin • 90 z Europy północnej i zachodniej

  14. Analiza mikromacierzy • wytworzenie mikromacierzy naniesienie na płytkę gotowych lub zsyntetyzowanych in situ sond długości 25 - 70 nukleotydów mikromacierz Sonda oligonukleotydowa http://www.affymetrix.com

  15. Analiza mikromacierzy • hybrydyzacja DNA na płytce zawierającej sondy http://www.affymetrix.com

  16. Analiza mikromacierzy • skanowanie http://www.affymetrix.com

  17. Analiza mikromacierzy • analiza ilościowa

  18. Analiza mikromacierzy • Affymetrix • Illumina

  19. Affymetrix • „chip” Affymetrix's Genome-Wide Human SNP Array 6.0 zawiera sondy dla 906 600 SNP i 946 000 CNV • strategia wyboru SNP: tylko połowa w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging „tagSNPs”, reszta to dowolne SNPs występujące w genomie • sondy 25-nukleotydowe, 4-6 kopii/zmianę • detekcja hybrydyzacja wyznakowanego DNA

  20. Trawienie enzymami restrykcyjnymi Ligacja z adapterem Nsp lub Sty Amplifikacja PCR z jednym starterem Oczyszczenie próbki Fragmentacja, znakowanie końców Hybrydyzacja http://www.affymetrix.com/estore/browse/products.jsp?categoryIdClicked=&productId=131534#1_1

  21. Illumina • „chip” HumanOmni2.5-Quad BeadChip zawiera > 2.45 milliona sond do badania SNPs i CNVs • strategia wyboru SNPs: w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging „tagSNPs” • sondy 50-nukleotydowe, 1/zmianę • detekcja wydłużanie sond z dobudowaniem znakowanych nukleotydów

  22. Genomowe DNA (200 - 400 ng) Amplifikacja DNA Fragmentacja DNA 2-etapowa detekcja Etap I Hybrydyzacja DNA z sondą Wydłużanie sond z dobudowaniem wyznakowanych nukleotydów Etap II http://www.illumina.com/technology/infinium_hd_assay.ilmn

  23. Zestawienie wykonanych GWAS • ~ 600 GWAS obejmujących różne grupy i populacje • 150 różnych zespołów np. cukrzyca typu I i II, choroba Crohna, choroba Alzheimera, schizofrenia, udar, choroby serca, nowotwory złośliwe, otyłość • > 50 000 SNP wyselekcjonowanych do walidacji • zidentyfikowano ~800 SNP związanych z chorobami (p<5×10-8) Johnson and O'Donnell, BMC Medical Genetics 2009 Manolio, NEJM 2010

  24. Manolio et al., NEJM 2010

  25. Badanie Wellcome Trust 2005-2007 • 8 ważnych schorzeń wieloczynnikowych • 19 000 osób (chorych i zdrowych) • 500 000 polimorfizmów (SNPs i CNVs) • 200 badaczy, • 9 milionów funtów https://www.wtccc.org.uk/ccc1/ Nature 2007, Nature 2010

  26. Wyniki badań Wellcome Trust • Choroba afektywna dwubiegunowa locus 16p12 (OR 2,08) • Choroba wieńcowa locus 9p21 (ORhet-hom 1,47-1,9) • Choroba Crohna • 5 znanych lokalizacji (ORhet-hom): NOD2 (1,29-1,92), IL23R (1,39-1,86), ATG16L1 (1,19-1,85), ZNF365 (1,23-1,55), locus 5p13.1 (1,54-2,32) • 4 nowe lokalizacje (ORhet-hom): IRGM (1,54-1,92), BSN (1,09-1,84), NKX2-3 (1,2-1,62), PTPN2 (1,3-2,01)

  27. Wyniki badań Wellcome Trust • Nadciśnienie brak wyraźnych czynników ryzyka - kilka wariantów o stosunkowo małym wpływie (OR 0,97-1,6) • Reumatoidalne zapalenie stawów • 9 znanych już lokalizacji (OR 0,91-2,3) • PTPN22 (ORhet-hom 1,98-3,32), region MHC (ORhet-hom 2,36-5,21) • korelacja z chorobami serca i cukrzycą typu I

  28. Wyniki badań Wellcome Trust • Cukrzyca typu I • 5 znanych lokalizacji, w tym gen PTPN22 (ORhet-hom 1,82-5,19) i MHC (ORhet-hom 5,49-18,52) • 3 nowe loci (ORhet-hom ): 12q13 (1,34-1,75), 12q24 (1,34-1,94), 16p13 (1,19-1,55) • Cukrzyca typu II TCFL2 (ORhet-hom 1,36-1,88), FTO (ORhet-hom 1,34-1,55), CDKAL1/CDKARAP1 (ORhet-hom 1,18-2,17)

  29. Znaczenie medyczne • identyfikacja grup zwiększonego ryzyka zachorowania na określone choroby • związek z pojedynczym markerem, tzw. „single effect” • sumowanie ryzyka, tzw. „additive effect” np. OR 1,62 (1 SNP) i OR 9,46 (≥5 SNPs) dla raka prostaty Pharoah et al. NEJM 2008 Zheng et al. NEJM 2008

  30. Zmiany zidentyfikowane w GWAS • funkcjonalne • niefunkcjonalne • markery genetyczne • identyfikują obszar/gen gdzie należy szukać właściwych mutacji

  31. Sekwencjonowanie DNA Technika umożliwiająca ustalenie kolejności zasad w DNA.

  32. Sangera – 1975 rok polega na terminacji łańcucha DNA przy wykorzystaniu zmodyfikowanych nukleotydów (dideoksynukleotydy) Maxama-Gilberta – 1977 rok polega na wykorzystaniu związków chemicznych do rozszczepiania łańcucha DNA

  33. automatyczne – 1987 rok oparte na metodyce Sangera http://www.answers.com/topic/dna-sequencing http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=225046&tabno=2

  34. 3730xl DNA Analyzer 96 kapilar 3 840 próbek/dobę 2 100 000 zasad/dobę do 900 zasad/próbkę http://www.mun.ca/biology/scarr/4241_RMC_Sequencing.html

  35. pirosekwencjonowanie – 1996 rok „sekwencjonowanie poprzez syntezę” w reakcji wykorzystywane są cztery enzymy: fragment Klenowa polimerazy DNA I sulfurylaza ATP lucyferaza apiraza. http://www.translational-medicine.com/content/1/1/9/figure/F5?highres=y

  36. PyroMark Q96 MD do 96 próbek analizowanych jednocześnie max. 300 - 500 zasad/próbkę do 960 próbek/dobę krótka procedura przygotowania próbek

  37. Sekwencjonowanie nowej generacji Analiza setek milionów lub miliardów par zasad w jednym ciągu reakcji, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów System 454 (Roche) HiSeq (Illumina) SOLiD (Applied Biosystems)

  38. System 454 w oparciu o pirosekwencjonowanie >1mln zasad/analizę 1 mld zasad/dobę do 450 zasad/próbkę czułość 99% koszt 7 000 $/analizę

  39. HiSeq2000 w oparciu o odwracalną reakcję terminacji jednoczesna analiza dwóch różnych próbek 200 mld zasad/analizę, 8 dni do 25 mld zasad/dobę do 100 zasad/próbkę czułość >99% koszt 10 000 $/analizę

  40. 5500xl SOLiD™ System w oparciu o ligację komplementarnych frag. jednoczesna analiza 12 różnych próbek 300 mld zasad/analizę, 7 dni do 45 mld zasad/dobę do 75 zasad/próbkę czułość 99.99% koszt 6 000 $/analizę

  41. Postęp w sekwencjonowaniu

  42. Podsumowanie • najlepsze efekty daje połączenie kilku metod • konieczne nowej jakości badania strukturalne i asocjacyjne : • RNA • białek • innych oddziaływań ze środowiskiem o nieznanym dotąd charakterze

More Related