Canali Voltaggio-dipendenti per il Ca 2+

1. Canali Voltaggio-dipendenti per il Ca2+

2. La struttura molecolare dei canali del Ca2+ è nel suo insieme del tutto simile a quella dei NaV, sebbene (piccole) differenze nelle sequenze cambino profondamente la selettività, il gating e la sensibilità ai farmaci. Le subunità alfa sono costantemente associate a subunità accessorie, in numero maggiore di quelle del Na+: α2, β, γ e δ. I canali del Ca VD sono tutti bloccati (pur con sensibilità diverse) dal Cadmio (Cd2+) e dai “metalli pesanti” (Ni2+, Co2+ e La3+).

3. Organizzazione strutturale dei canali del Ca VD Subunità a1: 4 domini omologhi (I-IV), con 6 segmenti transmembrana ciascuno; Subunità b: intracellulare, costituita da più a eliche; Subunità a2d: in giallo le regioni idrofobiche; I siti di interazione tra le subunità sono indicati da frecce bipolari.

4. Correnti di Ca HVA 0 mV Correnti di Ca LVA -40 mV 400 pA 100 pA 30 ms 30 ms Classificazione in base alle proprietà elettrofisiologiche: a) Canali LVA (low-voltage-activated (-70mV); avendo una spiccata inattivazione voltaggio-dipendente, sono stati chiamati canali T (“transient”). Sono sensibili all’amiloride. b) Canali HVA (high-voltage-activated (-30m/-20V); hanno un’inattivazione molto più lenta. Poi s’è visto che si tratta di una famiglia comprendente molti membri, che sono stati indicati da lettere (P, Q, R ecc.)

6. I diversi sottotipi di canali del Ca inattivano in maniera differente a1C (L) a1E (R) a1G (T) 50 ms

7. Possibile modello di inattivazione VD dei canali del Ca Il linker intracellulare tra i domini I e II potrebbe agire da particella inattivante che fisicamente occluderebbe il poro del canale interagendo, almeno in parte, con le regioni S6 dei domini II e III del canale. La subunità b del canale del Ca si associa con il linker tra i domini I-II modificando le proprietà dell’inattivazione; essa potrebbe interagire sia con la subunità a1 che con la membrana.

8. Possibile modello di inattivazione Ca-dipendente dei canali del Ca Un’elevata concentrazione di Ca intracellulare innesca l’inattivazione dei canali di tipo L. Il sensore per il Ca sarebbe una molecola di calmodulina (CaM). CaM è costitutivamente legata al complesso del canale. L’inattivazione avverrebbe tramite un’interazione Ca-dipendente della CaM legata con un motivo IQ-simile sulla coda carbossilica di a1C. È possibile che un meccanismo analogo intervenga anche a livello dei canali N, P/Q ed R (Peterson, Neuron, 1999). CHIUSO APERTO INATTIVATO Ca2+ Voltaggio • Nello stato chiuso (iperpolarizzato) l’accesso della CaM alla regione IQ-simile è ridotto. • Nello stato aperto (depolarizzato) la CaM legata ha un rapido accesso al dominio IQ-simile. • L’accumulo di Ca2+ sulla bocca interna del canaleporta all’attivazione Ca-dip. della CaM. • L’interazione di CaM-Ca2+ con la regione IQ-simile induce l’inattivazione del canale.

9. Canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ di tipo L I canali “L” o recettori per le di-idro-piridine (DHP, come la Nifedipina ola nimodipina) hanno un’enorme importanza in Fisiologia. Sono tipici del muscolo scheletrico, ma sono presenti anche nel cuore (*) e nel sistemanervoso. Hanno un’inattivazione più o meno lenta, che è ancheCa-dipendente. (*) il bloccante Verapamil viene impiegato nella cura della tachicardia parossitica

10. Nel muscolo scheletrico, i canali L sono addensati nei tubuli trasversi del reticolo sarcoplasmatico, dove funzionano da “sensori del voltaggio”. Sono accoppiati (con l’ansa di connessione II-III) ad altri canali del Ca2+ (Ca-dipendenti) presenti nei tubuli longitudinali del ret.sarc., detti “recettori della Ryanodina”. Si attiva così un il rilascio di Ca che attiva con grande rapidità (per feedback positivo) l’apparato contrattile. Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo scheletrico

11. RS TT - + - + A riposo 2+ + Ca - + - + Sensore Canale del volt. di rilascio Vm + - - + 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Depolarizzata Ca Ca Ca Ca Ca Ca + + - - + Modello per il rilascio voltaggio-dipendente del Ca2+

12. Canalopatie dove sono coinvolti canali del Ca2+ VD Si è osservato che la paralisi periodica ipokaliemica, che si manifesta con debolezza muscolare che compare all’adolescenza, è associata a mutazioni del gene del canale L (cromosoma 1). I segmenti S4 dei domini II o IV hanno meno Arg (quindi i canali hanno minor sensibilità al voltaggio) e l’inattivazione è più rapida. E’ comprensibile che queste caratteristiche riducano il rilascio intracellulare di Ca2+. Si pensa che mutazioni del gene del RYR (cromosoma 19) siano la causa della ipertermia maligna: un’anomala risposta all’anestesia generale con alotano e succinilcolina (convulsioni muscolari dovute ad unaumentato rilascio di Ca2+ intracellulare, aumento della temperatura corporea, squilibrio idrosalino) che risulta fatale in 1 caso su 20.000. La situazione è recentemente migliorata grazie alla diagnosi precoce ed all’uso del dantrolene, che inibisce il rilascio di Ca2+ da parte del ret.sarc. Può essere interessante ricordare che la mutazione è presente in tutti i maiali domestici (mentre manca nei porci selvatici) che presentano sensibilità all’alotano. E’ probabile che la mutazione sia stata selezionata (inconsapevolmente) dagli allevatori perché si accompagna ad aumento della massa muscolare.

13. TT SR TT SR + + + Vm Ca2+ Canale di rilascio Canale del Ca2+ Accoppiamento EC Cardiaco (Ca2+-induced-Ca2+-release) Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo cardiaco

14. Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo liscio Nel muscolo liscio, il ret.sarc. è praticamente assente. Qui l’attivazione dell’apparato contrattile (non organizzato in sarcomeri) è totalmente dipendente dal Ca2+ che entra attraverso i canali L della membrana plasmatica. • Il fenomeno dell’accoppiamento eccitazione  contrazione nei tessuti muscolari illustra bene la doppia importanza dei canali del Ca2+: • fanno entrare nella cellula ioni con carica positiva (similmente ai NaV) • fanno anche comparire nella cellula un vero e proprio secondo messaggero(gli ioni Ca2+) che ha uno straordinario potere regolatore di molti processi intracellulari

15. Un altro esempio di enorme importanza funzionale è l’ “esocitosi regolata” di vescicole (v. rilascio di insulina) in tutte le cellule secernenti (vedi LIBRO) Canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ di tipo N e P/Q nell’esocitosi Un caso particolarissimo di “esocitosi regolata” è la liberazione di vescicole contenenti neurotrasmettitore nella trasmissione sinaptica…. Qui operano canali “N” (per neuronal, bloccati dall’ ω-Conotossina), che sono esclusivi del SNC, ma anche canali “P” (da Purkinje, bloccati dall’ ω-Agatossina, i quali sono presenti sia nel SNC che nel cuore) e canali QedR <dipende dalla sinapsi>, per i quali non è noto alcun bloccante specifico.

16. Eventi pre-simnaptici Questi canali sono addensati nelle terminazioni presinaptiche, dove sono essenziali per il rilascio di neurotrasmettitore. In particolare sono presenti al centro dellezone attive alle quali sono ancorate le vescicole sinaptiche pronte al rilascio (“pool” di rilascio). Le zone attive sono formazioni del citoscheletro altamente ordinate, visibili in freeze fracture dal versante citoplasmatico della membrana presinaptica). In corrispondenza delle zone attive, i lipidi della membrana sono organizzati a formare dei “rafts” (zattere). L’arrivo del pda e la conseguente depolarizzazione della membrana presinaptica apre i canali del Ca2+ …. …. ed il Ca2+ fa scattare un complesso sistema di controllo (sul quale possono agire molte tossine batteriche e veleni animali). La fusione delle vescicole promossa dal Ca2+ è preceduta da fasi preliminari:

17. “Docking” (attracco) … • La T. botulinicaè il veleno più potente che si conosca • La sua dose letale è talmente bassa che ne basterebbe meno di 1 grammo per eliminare tutta la specie umana ! • Anche la T.tetanica agisce sul sistema di controllo della liberazione di vescicole sinaptiche B) “Priming” (preparazione) … La latratossina, il principio attivo del veleno della Vedova Nera, provoca la liberazione spontanea ed incontrollata delle vescicole C) all’arrivo del pda si ha la fusione Ca-dipendente(“Fusion”, preceduta dalla formazione di un poro attraverso il quale passerà il neurotrasmettitore), che consente l’esocitosi delle vescicole ancorate alle zone attive (“pool di rilascio”).

18. La trasmissione sinaptica La combinazione del neurotrasmettitore con i propri recettori presenti nella membrana postsinaptica consentirà la trasmissione sinaptica (una depolarizzazione [EPSP] nelle sinapsi eccitatorie o un’ iperpolarizzazione [IPSP] nelle sinapsi inibitorie…) Ma questa è una storia che riguarda i canali chemio-dipendenti …

19. Canali VD per il Ca2+ (solitamente del tipo L) sono anche presenti nella membrana presinapticaal di fuori delle zone attive (A). La loro attivazione (B) serve a distaccare le vescicole del “pool di deposito” dai filamenti di actina del citoscheletro, quindi a rifornire il “pool di rilascio”. Ruolo dei canali del Ca2+ al di fuori delle zone attive della membrana pre-sinaptica Lo schema C illustra il processo in maggior dettaglio. Anche in questo caso si mette bene in evidenza il ruolo del Ca2+ come secondo messaggero intracellulare !

20. Le zone attive della placca neuromuscolare (anch’esse visibili in freeze fracture dalla faccia citoplasmatica della membrana presinaptica) sono organizzate in modo diverso.. Zone attive della placca neuro-muscolare Sono delle “strisce” altamente organizzate, ognuna delle quali assomiglia ad una serie di “costole” articolate su di una “colonna vertebrale”, ma l’intervento dei canali del Ca2+ (visibili assieme ai pori di fusione dalla faccia della m. presinaptica che dà verso la fessura sinaptica) nel rilascio diacetilcolina (*) è concettualmente identico. (*) nelle sinapsi centrali il neurotrasmettitore eccitatorio è quasi sempre l’acido glutamico

21. Movimenti (compreso il battito cardiaco), sensazioni, pensieri, emozioni (tutte le funzioni del sistema nervoso dipendenti dalla trasmissione sinaptica) …. avvengono grazie alla presenza di un complesso sistema di canali ionici che abbiamo appena cominciato ad esaminare. Naturalmente, si tratta di una condizione necessaria (queste funzioni sono impedite o compromesse se i canali ionici vengono messi fuori uso) … … ma non sufficiente, cioè i canali ionici, per essere utili, devono operare in un contesto altamente ordinato di membrane, trasporti attivi, organuli intracellulari, collegamenti intracellulari, ecc…

22. L’ingresso di Ca2+ depolarizza la cellula Il fondamentale ruolo del Ca2+ come “messaggero” intracellulare non deve far dimenticare che si tratta di un catione, e che il suo ingresso in cellula per apertura di canali voltaggio-dipendenti avrà degli effetti elettrici sul potenziale di membrana. In prima approssimazione, è prevedibile che questo ingresso determinerà una depolarizzazione. Ma c’è di più: infatti l’ingresso di cariche positive attraverso canali VD attivati dalla depolarizzazione, in modo del tutto analogo a quanto avviene nel caso del Na+ (A, ma a differenza di quanto avviene per i canali del K+, B), può facilmente diventare autorigenerativo e dar luogo a veri e propri potenziali d’azione al Ca2+.

23. gCa= 0 10 nA 1.5 s gCa= 2 mS 10 nA La presenza di canali del calcio aumenta l’eccitabilità neuronale gCa aiuta a raggiungere la soglia

24. Solitamente l’ingresso di Ca2+ attraverso canali VD accompagna (e prolunga) i pda al Na+. E’ il caso delle fibrocellule muscolari scheletriche, ma soprattutto delle fibrocellule muscolari cardiache. Ruolo dei canali voltaggio-dipendenti per il Ca nel PdA cardiaco (tessuto di lavoro) Qui l’ingresso di Ca2+ non solo potenzia l’effetto del Na+ nella fase iniziale del pda (depolarizzazione ed overshoot), ma perdura anche quando i canali del Na+ si sono inattivati (l’inattivazione dei canali del Ca2+ c’è, ma è incompleta), dando luogo ad un lungo “plateau”. Domanda: ma se durante il plateau entrano cariche positive sotto forma di ioni Ca2+, perché il pdm si mantiene costante <attorno allo zero> ? Risposta: perché durante il “plateau” la corrente entrante di Ca2+ è esattamente controbilanciata da una corrente uscente di K+ <attraverso canali al K+ che incontreremo tra breve>

25. Questo lunghissimo “plateau” del pda cardiaco è funzionalmente importante per due buone ragioni: a) il Ca2+ che entra attraverso i canali (L) della membrana plasmatica attiverà il “Ca-activated Ca-release” del reticolo sarcoplasmatico, quindi la contrazione del cuore; b) mantenendo depolarizzata la membrana, la rende ineccitabileper tutta la sua durata(perché mantiene inattivati i canali del Na+). In altre parole: durante il plateau, il cuore si trova in uno stato di refrattarietà assoluta, quindi per tutta la durata della contrazione (della sistole) non può essere nuovamente eccitato. La situazione è molto diversa da quella che si ha nel muscolo scheletrico, nel quale la refrattarietà assoluta termina ancor prima che inizi la contrazione.

26. Il muscolo scheletrico infatti (per fortuna !)ètetanizzabile, cioè le singole “scosse” possono sommarsi tra loro fino alla completa fusione, producendo un aumento della forza contrattile. Di fatto, la maggior parte delle nostre contrazioni sono dei “tetani”. Il cuore invece (per fortuna !) non è “tetanizzabile”: qualunque stimolo “ectopico” è inefficace per tutta la durata della sistole (I), e può produrre una seconda contrazione (“extrasistole”) solo mentre il cuore si sta rilasciando.. Ma qui stiamo uscendo dal seminato !

27. Potenziali d’azione al Ca2+ nelle cellule pacemaker cardiache Non mancano esempi di pda sostenuti solo dall’ingresso autorigenerativo di Ca2+, come il gigantesco pda delle cellule del Purkinje del cervelletto, evocato dalla stimolazione delle fibre rampicanti (attivazione di canali P). Un altro esempio funzionalmente molto rilevante è quello del miocardio di conduzione (tessuto “pacemaker” del cuore). Questi pda al Ca2+ si generano spontaneamente (o meglio, per effetto dell’automatismotipico del pacemaker), e poi si propagano a tutte le fibrocellule del miocardio di lavoro (che di per sé resterebbero in riposo). Queste, eccitate, genereranno i pda provvisti di “plateau” che abbiamo visto prima. Curiosamente, nel miocardio di conduzione il contributo del Na+ non manca perché i canali del Na+ siano assent:. questi ci sono, ma non entrano in gioco perché sono sempre inattivati (nel tessuto pacemaker, il potenziale di membrana non diviene mai sufficientemente negativo da rimuoverne l’inattivazione).

28. L’esempio del pda (al Ca2+) del pacemaker cardiaco ci offre l’opportunità di parlare di un altro tipo di canali voltaggio-dipendenti: i canali “f” (“funny”), espressi anche in molti neuroni autoritmici del SNC (dove vengono chiamati canali “h”) Interazione tra canali “T” e canali “f” I canali del Ca2+ di tipo L (e T) sostengono il pda, ma per essere attivati necessitano di una depolarizzazione della membrana. Questa, nelle cellule autoritmiche, avviene “spontaneamente” e si chiama prepotenziale. Nel tessuto pacemaker, il prepotenziale (e con esso l’automatismo cardiaco) è generato dall’apertura dei canali-f .

29. Modulazione dei Canali “f” Di grande importanza è la “modulazione” (variazione della sensibilità al voltaggio) dei canali f operata dall’orto- e dal para-simpatico tramite i rispettivi neurotrasmettitori <noradrenalina(+adrenalina) ed acetilcolina>. Modulando i canali f, l’orto- ed il para-simpatico regolano la frequenza cardiaca (!!), come se fossero l’uno l’acceleratore e l’altro il freno di un’automobile. Questi neurotrasmettitori agiscono su recettori accoppiati a proteine-G e fanno rispettivamente aumentare e diminuire il livello intracellulatre di AMPc. I canali f sono voltaggio-dipendenti, ma anchechemio-dipendenti (dal versante intracellulare), una condizione tutt’altro che infrequente.

30. Correnti T neuronali e spikes al Ca2+ Vhold-90 mV

31. Attività oscillatoria -65 mV PdA al Na+ attivazione IT Spike al Ca 2+ -65 mV ------ deattivazione Ih inattivazione IT attivazione Ih Potenziale pacemaker rimozione inattivazione IT Attività ritmica spontanea in un neurone talamico Bursts di PdA dovuti all’interazione della corrente di Ca2+ IT con la corrente pacemaker entrante Ih 1 s

32. La struttura dei canali HCN Appartengono alla classe dei canali HCN: “canali cationiciattivati dall’iperpolarizzazione”. Vengono attivati alla fine di ogni pda, quando la membrana si iperpolarizza. La loro apertura genera una corrente entrante che, depolarizzando la membrana, produce il prepotenziale, quindi il pda successivo. Una subunità presenta: • 6-DTM come i canali Kv • S4 riconosciuto come sensore del voltaggio per l'elevata presenza di residui carichi positivamente • motivo GYG nel linker S5-S6, tipico del filtro di selettività dei canali Kv • nel C-terminale è presente un dominio CNB come nei canali CNG • si pensa che i canali siano formati da TETRAMERI come i canali Kv indietro