ELISA

1. ELISA EnzymeLinkedImmuneSorbentAssay ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

2. enzim enzyme linked immune sorbent felülethez kötött antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim

3. Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás Az enzimaktivitás mértékére a színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunológiai módszer

4. Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés Antigén Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Indirekt módszer Direkt módszer egyszerűség több jel  nagyobb érzékenység Primer ellenanyag

5. Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyagok Szekunder ellenanyagok Primer ellenanyag Antigén Enzim-antienzim rendszer (leginkább immunhisztokémiában lehet találkozni vele) PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz

6. avidin biotin enzimcomplexek (arányok!!! mint a precipitációnál) Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotinált ellenanyag Antigén Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC

7. Példák a direkt, indirekt és kompetitív ELISA módszerekre

8. Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása egyszerű indirekt ELISA lépései Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatása felesleges ellenanyagok kimosása az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) (az enyhén lúgos puffer segíti a kitapadást) felesleges antigén kimosása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével specifikus ellenanyagok hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

9. kombinált szendvicsELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek) kimutatása szendvics technikával antigén specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges konjugátum kimosása A nem kötődött anyagok kimosása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges ellenanyagok kimosása antigént tartalmazó folyadék hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

10. kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolúbilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a korábban a szilárd fázishoz tapasztott antigénhez. - Antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása • Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

11. ELISA alaptípusok (összefoglalás) capture/szendvics egyszerű Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag detektor/reporter ellenanyag Ag specifikus ellenanyag antigén Ag specifikus capture ellenanyag antigén kompetitív Ag specifikus ellenanyag antigén pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához antigének kimutatásához az oldatban jelen van a kimutatandó Ag nincs jelen oldott Ag antigének kimutatásához, ha csak egyféle specifikus ellenanyagunk van, vagy kis mennyiségű antigén kimutatásához

12. ELISA Aspecifikus kitapadásból eredő hiba Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az • A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: • telítéssel/fedéssel/blokkolással • detergens alkalmazásával

13. Gyakorlati feladat: Indirekt ELISA (az anti-BSA kimutatása) -kromogén anyag (OPD+H2O2) -avidinnal konjugált HRPO -biotinnalal konjugált anti-nyúl ellenanyag -Nyúl anti-BSA ellenanyag -BSA Így lesznek kikészítve a plate-ek (HRPO – torma peroxidáz (Horseradish Peroxidase)) Hozzá lehet fogni a gyakorlathoz, és az inkubálási idők alatt folytatni a vetítést.

14. ELISA alapú módszerek: emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak Vírusfertőzések diagnosztikája Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia, vagy az immunválsz miatt), ezért helyette inkább a fertőzött szervezetben a vírus ellen képződött ellenanyagokat próbálják meg kimutatni a diagnosztika során. • ilyen elven működik: • Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t • HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból, vagy akár beszáradt vérfoltból • Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás • léteznek gyors egylépéses lateral flow immunkromatográfiás tesztek is

15. A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek: Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak. Immunfluoreszcens vizsgálat: A teszt immortalizált, a felszínén HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget.

16. Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják, vagy…. Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában, immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

17. Tumordiagnosztika Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (a beteg széruma) Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal fedett felület (a kit része) • A tumor specifikus(TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában • Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Prosztata daganatok Prostate-Specific Antigen (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. Hasonlóan használható fel a human prostatic acid phosphatase (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

18. izotípus specifikus ellenanyag a szérum ellenanyaga ellenanyag capture-ellenanyag Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál) Az így kimutaott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető αIgM αIgG Memória válasz IgM IgG Antigén • Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópiás allergiák esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében • Egyes immundeficienciákan az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma)

19. Bioaktív anyagok kimutatása hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek doppingvizsgálatok: EPO, szteroid származékok kimutatása szendvics technikával, vagy kompetíciós tesztekkel

20. Diagnosztikai gyorstesztek: Mindenki látott már ehhez hasonló diagnosztikai eszközöket, vagy ha nem, - találkozni fog velük későbbi pályafutása során: pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumbú, vagy vizeletbű (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

21. hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal oldalnézet elölnézet abszorbciós rész (cellulóz, papír) kontroll ellenanyag sáv nitrocellulóz membrán hCG capture ellenanyag sáv jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta különböző elnevezéseivel találkozni: lateral flow immunoassay v. immunkromatográfia v. flow-through membrane technology

22. a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok nincs hCG van hCG kontroll sáv teszt sáv kontroll ellenanyag sáv hCG capture ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok hCG

23. Ugyanez kompetitív rendszerben nincs hCG van hCG kontroll sáv teszt sáv kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok hCG sáv ( kikötött hCG)

24. International Journal of Food Microbiology 99 (2005) 185– 194 • Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre pl.: • kolloidális arany („surface plasmon rezonancia színek”) • festékkel töltött latex gyöngyök Az eljárás szemikvantitatívá tehető kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására

25. ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot • Elve hasonlít az ELISA-hoz • Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának meghatározására szolgált. • Ma alkalmas egyéb szolúbilis effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is. • Egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására. • Érzékenység: kb. 1 per 300 000 sejt • Sejtkultúra felhasználásával aszeptikus körülmények között végezzük.

26. ELISPOT A mérés menete - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása (aktiválás, inkubáció) - mosás - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása (például) - avidin-enzim konjugátum Az ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal - oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol) A citokin termlő sejt helyét mutató folt

27. Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

28. A spotok száma az ellenanyag vagy citokin termelő sejtek számát mutatja A spotok mérete arányos az ellenanyag vagy citokin termelő képességgel A spotok által elfoglalt terület mindkét paramétert egyesíti, a számítógépes szoftver mindkettőt figyelembe veszi

29. Western blot Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő specifikus kimutatására alkalmas. Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is vizsgálható vele. • Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei sok, legalább 106 sejt szükséges a vizsgálathoz

30. Anode - A fehérjék SDS-PAGE-enelektroforetikus mobilitásuk alapján „méret” szerint szétválaszthatók (dot-blot vagy slot-blot esetén nincs szétválasztás) A hozzávatőleges méretet ismert méretű standard fehérje keverék egyidejű futtatásával meghatározhatjuk. Cathode + + A kezelhetőség érdekében a szétválasztott fehérje sávokat nitrocellulóz membránra viszik át - Specifikus ellenanyaggal mutatható ki a keresett fehérje sávja a többi sáv között, (vagy anti-foszfotirozin elleanyaggal a foszforilált fehérjék sávja)

31. pl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotja A membrán az anti P-Y ellenanyagok elúciója után anti ZAP-70 ellenanyagokkal is megjelölhető, így azonosítható a ZAP-70 foszforilációs állapota a sejtekben aktiválatlan ConA PHA Y P-Y P-Y P-Y blot

32. Enhanced chemiluminescence (ECL) Felerősített kemilumineszcencia módszer • H2O2 jelenlétében a luminol a peroxidaz enzim által katalizált oxidációs folyamat során gerjesztődik, majd • emittál egyfotont, és visszakerül az alapállapotba • Ez a foton detektálható filmen vagy kameraval. • a fényemisszió felerősíthető fenolgyűrűs vegyületek jelenlétében(6-hydroxybenzothiazole)(enhancer) Kitapasztott Fehérje (AG) Primary antibody Fab Fc torma peroxidaz luminol H2O2 h Epitope a protein felszínén luminol erősítő Detektor H2O Secondary antibody Membrán

33. Immunhisztokémia / Immunfluoreszcencia • Szöveti vagy sejthez kötött komponenseket mutathatunk ki specifikus • AG- EA reakció alapján. (a fixált szövetmetszet szilárd fázisnak felel meg.) • Fixálás: A minta átjárható legyen és az Ag determinánsok ne károsodjanak (paraformaldehid, glutáraldehid) – (szövetmintától függő) • Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a • szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban • Immunfluoreszcencia • fluoreszcensen jelzett ellenanyag • – fluoreszcens mikroszkóp • FITC – fluoreszcein izotiocianát • PE – fikoeritrin • Immunoenzim módszer • enzimmel konjugált ellenanyag • P – peroxidáz • PA – alkalikus foszfatáz • (a szubsztátból oldhatatlan, színes • csapadékot képeznek) Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

34. Szövetminta IMMUNHISZTOKÉMIA FIXÁLÁS METSZÉS Festés előtti metszet FAGYASZTÁS

35. ImmunhisztokémiaABC Technika Enzim Avidin X Biotin Secunder antitest Primer antitest Tárgylemez Sejtek (sejttenyészetek) Szövetmetszet

36. (nem immun)Hisztokémia Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)

37. Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

38. Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

39. Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actinjelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagotTO-PRO-3 jodiddal festették meg.

40. Peroxiszómák kimutatása fixált és permeabilizált endothel sejtben (pulmonáris artéria). A peroxiszómák detektálásához peroxiszómális membrán protein 70 elleni monoklonális egér ellenanyagot és Alexa Fluor 488 festékkel jelölt kecske anti-egér IgG-t használtak. A mitokondriumokat MitoTracker Red festékkel jelölték meg a fixálás előtt; a sejtmag kimutatása DAPI festékkel történt.

41. Bioassay Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók. pl. CTLL2 sejtek van IL-2 nincs IL-2 pl. Wehi 164 sejtek van TNF nincs TNF

42. A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg. citokinkoncentráció CTLL2 IL-2 Wehi 164 TNF MTT assay: Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL2.

43. „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok

44. ( + ) IL-2 IL-4 … MIP3β … IFN … ( - ) Cytokine array Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít különféle kikötött specifikus ellenanyagok „Lumineszcens elleanyag” keverék Vizsgálandó citokin tartalmú oldat Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

45. CD40L és CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokintermelése Réthi és mtsi. 2006

46. Cytometric bead array (CBA) IL-2 IL-4 IL-8 … … IL-12 IL-23 IL-17 … … A cyitokine array-hez hasonló alapelvű, áramlási citometriás módszer A citokineket itt nem a pozíciójuk, hanem különböző színintenzitású gyöngyök azonosítják cytokine array CBA

47. Cytometric bead array (CBA) A CBA elve és összehasonlítása a hagyományos ELISAval Szendvics ELISA CBA

48. Cytometric Bead Array IL-2 IL-4 … … A citokinek mennyiségére egy eltérő színnel jelölt ellenanyag fényintenzitásából következtethetünk reporter ellenanyag citokin citokin capture gyöngy Standard citokinek a koncentráció meghatározásához kis térfogatokkal is működik, de műszerigényes

49. Citokin mennyiség Citokin standard TNFα IL-6 IL-8 IL-12 IL-10 IL-1β