Αμεση ELISA (direct ELISA)

1. ΤΥΠΟΙ ELISA Αμεση ELISA(direct ELISA) 2. σημασμένο αντι-αντίσωμα 1. αντίσωμα για τον ποσοτικό προσδιορισμό Ab στον ορό Εμμεση ELISA (indirect ELISA) A 3. σημασμένο αντι-αντίσωμα 2. αντίσωμα 1. αντιγόνο για τον προσδιορισμό αντιγονο-ειδικών Ab στον ορό B 4. σημασμένο αντι-αντίσωμα 3. aντι-ισότυπου Αb 2. αντίσωμα 1. αντιγόνο για τον προσδιορισμό του ισότυπουτου αντιγονο-ειδικού Ab στον ορό

2. SandwichELISΑ μεγάλη ευαισθησία ! single sandwich 3. σημασμένο μονοκλωνικό Ab 2. αντιγόνο 1. πολυκλωνικό Ab για τον προσδιορισμό διαλυτού αντιγόνου, π.χ. κυτταροκινών double sandwich 4. σημασμένοπολυκλωνικό Ab 3. μονοκλωνικό Ab 2. αντιγόνο 1. πολυκλωνικό Ab Όσο μεγαλύτερη η αλυσίδα των προσδέσεων τόσο μεγαλύτερη η εξειδίκευση! για τον προσδιορισμό διαλυτού αντιγόνου ή • 4. σημασμένο Ab • 3. αντιγόνο • 2. μονοκλωνικό Ab • πολυκλωνικό Ab για τον προσδιορισμό διαλυτού αντισώματος (διαθέσιμο ειδικό αντίσωμα αλλά όχι καθαρό αντιγόνο)

3. Αμεση ανταγωνιστική ELISA(direct competitive ELISA) Α με ανταγωνιστικό αντιγόνο χωρίς ανταγωνιστικό αντιγόνο 3. σημασμένο αντίσωμα 2. ανταγωνιστικό αντιγόνο 1. αντιγόνο 2. σημασμένο αντίσωμα 1. αντιγόνο για τον γρήγορο προσδιορισμό διαλυτού αντιγόνου (εξειδίκευση) (άριστη στον προσδιορισμό αντιγονικής διασταυρούμενης αντίδρασης) Β με ανταγωνιστικό αντίσωμα χωρίς ανταγωνιστικό αντίσωμα (μη σημασμένο) 3. σημασμένο αντίσωμα 2. ανταγωνιστικό αντίσωμα 1. αντιγόνο 2. σημασμένο αντίσωμα 1. αντιγόνο για τον προσδιορισμό της εξειδίκευσης του αντισώματος

4. Διαφορές των τεχνικών ανοσοφθορισμού (IFT), ELISA και ανοσοστυπώματος (WESTERN) IFTELISAWESTERN φυσική πρωτείνη φυσική πρωτείνη αποδιαταγμένη πρωτείνη (αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών) ποιοτική ποσοτική ποιοτική ημι-ποιοτική μέγιστη ευαισθησία λιγότερη ευαισθησία ελάχιστη ευαισθησία ελάχιστη εξειδίκευση μεγαλύτερη εξειδίκευση μέγιστη εξειδίκευση (όσο μεγαλύτερη η αλυσίδα των αντιδράσεων/προσδέσεων τόσο μεγαλύτερη η εξειδίκευση) εντοπισμός Αg ανάλυση μεμονωμένων ταυτοποίηση του μοριακού βάρους καθαρών Ag ή Ab αποκλεισμός άλλων πρωτεϊνών με τη χρήση ειδικών Ab

5. Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων Για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων ακολουθείται η εξής διαδικασία: Ζώα (συνήθως ποντικοί ή αρουραίοι) ανοσοποιούνται με αντιγόνο. Μόλις τα ζώα δώσουν μια ικανοποιητική αντισωμική απόκριση, τότε αφαιρούνται οι σπλήνες και παρασκευάζεται εναιώρημα κυττάρων (μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν και κύτταρα λεμφογαγγλίων). Αυτά τα κύτταρα συντήκονται με κυτταρική σειρά από μυέλωμα, με την προσθήκη πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG) η οποία προάγει τη σύντηξη μεμβρανών. Μόνον ένα μικρό ποσοστό των κυττάρων συντήκονται με επιτυχία. Το μίγμα της σύντηξης τοποθετείται τότε σε καλλιέργεια, με καλλιεργητικό μέσο που περιέχει “HAT”.

6. To ΗΑΤ είναι ένα μίγμα από υποξανθίνη (Η), αμινοπτερίνη (Α) και θυμιδίνη (Τ). Η αμινοπτερίνη είναι μια ισχυρή τοξίνη η οποία διακόπτει μια μεταβολική οδό. Αυτή η οδός μπορεί να παρακαμφθεί εάν το κύτταρο προμηθευφθεί τους ενδιάμεσους μεταβολίτες υποξανθίνη και θυμιδίνη. Ετσι τα σπληνοκύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν σε μέσο ΗΑΤ, αλλά τα μυελωματικά κύτταρα αποθνήσκουν σε μέσο ΗΑΤ, διότι έχουν ένα μεταβολικό ελάττωμα και δεν μπορούν να κάνουν χρήση της παρακαμπτήριας οδού. Όταν η καλλιέργεια αναπτυχθεί σε μέσο ΗΑΤ περιέχει σπληνοκύτταρα, μυελωματικά κύτταρα και συντηγμένα κύτταρα. Τα σπληνοκύτταρα πεθαίνουν στην καλλιέργεια φυσιολογικά μετά από 1-2 εβδομάδες, τα δε μυελωματικά κύτταρα φονεύονται από το ΗΑΤ. Τα συντηγμένα όμως κύτταρα επιβιώνουν επειδή διαθέτουν την αθανασία του μυελώματος και τη μεταβολική παράκαμψη των σπληνοκυττάρων. Μερικά από αυτά θα έχουν επίσης την ικανότητα των σπληνοκυττάρων προς παραγωγή αντισωμάτων. Τα φρεάτια που περιέχουν αναπτυσσόμενα κύτταρα εξετάζονται για την παραγωγή του επιθυμητού αντισώματος (συχνά με ανοσοδοκιμασία στερεάς φάσης) και εάν βρεθούν θετικά, οι καλλιέργειες κλωνοποιούνται, δηλαδή τοποθετούνται σε πλακίδιο έτσι ώστε σε κάθε φρεάτιο να υπάρχει μόνον ένα κύτταρο. Αυτό παράγει έναν κλώνο κυττάρων που προέρχονται από ένα μοναδικό προγονικό κύτταρο το οποίο είναι αθάνατο και παράγει μονοκλωνικό αντίσωμα. Δημιουργώντας έναν κλώνο από αθάνατα κύτταρα τα οποία συνθέτουν ένα μοναδικό αντίσωμα καθορισμένης εξειδίκευσης, έχουμε παραγωγή, η οποία μπορεί να συντηρηθεί επ’αόριστο. Ετσι μπορούμε να αποκτήσουμε καθαρά αντισώματα καθορισμένης εξειδίκευσης, τα μονοκλωνικά αντισώματα. Τα μονοκλωνικά αντισώματα παρουσιάζουν ομοιομορφία σε αντίθεση με τα αντισώματα του αντιορού. Τα μονοκλωνικά αντισώματα έχουν ευρεία εφαρμογή σε πολλές βιολογικές επιστήμες, όπου το αντίσωμα χρησιμοποιείται ως ανιχνευτής υψηλής εξειδίκευσης.