Maligní přeměna buňky

1. Maligní přeměna buňky • Tyto procesy jsou u vyšších organismů regulovány mnohastupňovými mechanismy, které zahrnují intra-celulární a extracelulární kontrolní dráhy. • Proces onkogeneze na buněčné úrovni je úzce spjat s kontrolou buněčné proliferace, diferenciace a progra-mované smrti buněk. • Většina, pokud ne všechny, nádorové buňky obsahují mnohočetné genetické změny, které pravděpodobně podporují proces tumorigeneze právě poškozováním důležitých kontrolních drah.

2. Prvním typem poškození jsou poruchy jejímž cílem jsou protoonkogeny. Tato poškození jsou zodpovědné za vyvolání stimulačních účinků na růst buněk Druhým typem poškození jsou poruchy, se kterými se setkáváme u antionkogenů. Poruchy ovlivňující antionkogeny jsou zodpovědné za ztrátu jejich inhibiční funkce. U nádorových onemocnění se takřka pravidelně setkáváme se dvěma základními typy genetických poškození

3. ONKOGENY – definice Genetická informace inkorporovaná v genomu hostitelské buňky (protoonkogen = potenciální onkogen), která po svéaktivaci(onkogen) je schopna vyvolat její neoplastickou transformaci. Protoonkogen může být aktivovánbodovou mutací, amplifikací, translokací (delece, přestavba chromosomu), transdukcí, inzerční mutagenezí.

4. Aktivace onkogenů 1. Změny ve struktuře genu mající za následek syntézu abnormálního genového produktu (onkoproteinu), který má změněnou funkci. • Změny ovlivňující regulaci genové exprese, které vedou ke zvýšené nebo nepřiměřené produkci strukturně nezměněné formy normálního proteinu podporujícího růst. a) Inserce retrovirů do buněčného genomu ovlivňuje kontrolu buněčných genů silnými retrovirovými promotory což má za následek konstitutivní produkci normálního proteinu. b) Klasickým případem mutační aktivace protoonkogenů jsou bodové mutace ve specifických kodonech genu ras, se kterými se setkáváme u mnoha typů nádorových onemocnění. • Genové amplifikace protoonkogenů jsou zodpovědné za zvýšení produkci DNA matrice pro tvorbu RNA což má za následek nesprávnou expresi kódovaných proteinů. • Chromosomální translokaceprotoonkogenůmohou mít za následekabnormální transkripční regulaci postižených genů nebo vznik zkrácených nebo fúzovaných genů s abnormální funkcí.

5. ONKOGENY – aktivace bodovou mutací Bodová mutace – prostá záměna nukleotidu v sekvenci NA vedoucí ke změně v pořadí aminokyselin produktu. Nejlépe demonstrováno na genech rodinyras,kde bodová mutace má vliv na vazbu proteinových produktů genů ras k proteinu GAP (GTPase activating protein).

6. ONKOGENY – aktivace amplifikací Amplifikace – zmnožení genu (někdy zaměňováno se zvýšenou expresí genu – overexpresí). Důsledky jsou podobné. Příčiny nejasné. Protože amplifikace bývá spojena se zřetelnými chromosomálními abnormitami a strukturálními alteracemi genů, nevylučuje se, že příčinami mohou být mnohočetné mutace a genová přeskupení (rearrangement). Amplifikace byla prokázána v četných nádorech. Příkladem je amplifikaceN-mycv neuroblastomu neboL-mycv malobuněčném karcinomu plic.

7. ONKOGENY – aktivace translokací Translokace – přesuny, mohou mít vli buď na expresi nebo funkci protoonkogenů. Např. při translokaci během níž dojde k připojeníc-mycčic-bcl-2ke genům pro syntézu Ig (Burkittův lymfom, folikulární ML) neboc-ablk oblasti bcr (break-point cluster region) (CML).

8. ONKOGENY – aktivace transdukcí Transdukce – implantace buněčného protoonkogenu do virového genomu. Tato inkorporace způsobuje zpravidla vysokou expresi transdukovaného genu (overexpresi) a z toho vyplývající nepříznivý vliv na buněčnou homeostázu. Jako transduktory se uplatňují zejména tzv.akutně transformující retroviryjako např. virus Rausova sarkomu.

9. ONKOGENY – aktivace izerční mutagenezí Inzerční mutageneze – vložení (inzerce) retrovirovýchpromotorů a zesilovačů (enhancerů)do genomu hostitelské buňky, zpravidla do blízkosti protoonkogenu (např. c-myc nebo c-erbB). Obvykle to vede ke vzniku nesmrtelné buněčné linie, ale nestačí to k zahájení kompletní maligní transformace.

10. ONKOGENY – rozdělení • Onkogeny kódující faktory regulující transkripci myc, jun, fos .... • Onkogeny kódující protein-kinázy src, abl, erb .... • Onkogeny kódující růstové faktory int, sis .... • Onkogeny kódující signální transduktory ras .... • Onkogeny inaktivující supresorové geny E6, E7, mdm-2 .... • Onkogeny blokující apoptózu bcl-2, bcl-X ... • Defektní supresorové a antimetastatické geny p53, Rb, WT1, DCC, NF1, APC .... nm-23 ....

11. Onkogeny - I • Původní poznatky o podstatě molekulární kontroly tvorby nádorů a objevení onkogenů jsou spojeny se studiemi zabývajícími se RNA nádorovými retroviry. • Virové onkogeny jsou segmenty virového genomu, které vyvolávají neoplastickou buněčnou transformaci in vitro a podporují patogenézu virem indukovaných nádorů in vivo. • Shodné homologní sekvence byly nalezeny v genomu většiny eukaryotických buněk. • Tyto sekvence jsou evolučně zachovány mezi různými druhy organismů, což potvrzuje jejich důležitost pro základní buněčné funkce. • Homology všech těchto virových a buněčných genů majících transformační účinky a vyskytujících se v normálních buňkách se nazývají protoonkogeny.

12. Přehled onkogenních virů a některých jejich vlastností virus přirozený hostitel hostitel nádoru typ nádoru onkogenní protein HerpesviryEBV člověk člověk Burkittův l. EBNA2, LMP1 Hodgkinova ch. nasofaryngeální k. žaludeční k. atd. ------------------------------------------------------------------------------------------------ HHV-8 člověk člověk Kapossiho sarkom cyklin D, vIL-6 Papovavirypolyoma v. myš myš různé stř. a vel. T antigen ------------------------------------------------------------------------------------------------ SV40 opice křeček, potkan různé vel. T antigen ------------------------------------------------------------------------------------------------ HPV16-18 člověk člověk kožní k. E6, E7 cervikální k. anogenitální k. Hepadnaviry HBV,HCV člověk člověk hepatocelulární k. X protein Adenoviry HAV–A,B,C člověk křeček, potkan různé E1A, E1B Retroviry HTLV-1 člověk člověk T-lymfocytární leuk./l. Tax

13. Onkogeny - II • Proteiny kódované protoonkogeny modulují celou řadu biochemických drah, které kontrolují genovou expresi, cytoskeletální architekturu a buněčný metabolismus tedy procesy zodpovědné za regulaci progrese buněčného cyklu a buněčných diferenciačních programů. • Obecně je známo, že proliferační kapacita se snižuje se stupněm diferenciace buněk. • Jinak lze říci, že zvýšená buněčná proliferace indukovaná jakýmkoliv onkogenem nemusí representovat přímý efekt na regulaci buněčného cyklu, ale může být důsledkem snížení diferenciačního potenciálu buňky. • Cytogenetické poruchy, které jsou zodpovědné za přeměnu normální regulační funkce protoonkogenů na jejich transformující funkci se podílejí na aktivaci onkogenů.

14. Přehled nejznámějších onkogenů – I 1. Geny pro růstové faktory jako onkogeny Růstové faktory, které stimulují proliferaci normálních buněk hrají důležitou roli při procesu maligní přeměny buňky [TGF (transforming growth factor ), se vyskytují u celé řady nádorů různorodého histogenetického původu, c-sis kóduje -řetězec PDGF (platelet-derived growth factor); produkce PDGF byla nalezena u celé řady nádorů zejména pak u astrocytomů a osteosarkomů] 2. Geny pro receptory růstových faktorů jako onkogeny Některé onkogeny byly identifikovány jako deletované nebo nepatřičně exprimované receptory růstových faktorů [Mezi nejznámější členy rodiny EGFR (epidermal growth factor receptor) patří tři geny (c-erb B1, c-erb B2, c-erb B3)]; c-erb B1 aberantně exprimován u spinocelulárního karcinomu plic a méně často u karcinomů močového měchýře, GIT a astrocytomů; c-erb B2 (nebo c-neu) je amplifikován u vysokého procenta lidských karcinomů prsu, ovária, adenokarcinomů plic, žaludku a slinných žláz; c-erb B3 je možno sledovat u karcinomů prsu;

15. Přehled nejznámějších onkogenů – II 3.Geny pro přenašeče signálů jako onkogeny a) Onkogeny s aktivitou přenašečů signálu vázaných na membránuTyto onkogeny můžeme rozdělit podle povahy produktů na skupinu s aktivitou tyrozin kinázovou a skupinu s aktivit GTP-ázovou b) Cytoplasmatické přenašeče signálů jako onkogeny Tyto onkogeny a jejich buněčné homology kódují cytoplasmické proteiny mající serin/treonin kinázovou aktivitu. 4. Jaderné transkripční faktory jako onkogeny Všechny dráhy podílející se na přenosu signálů vstupují do jádra a ovlivňují velkou skupinu genů, které řídí buňku. Tento proces (např. DNA replikace a buněčného dělení) je regulován geny, jejichž produkty jsou lokalizovány v jádře kde kontrolují transkripci genů regulujících buněčný růst.

16. Přehled nejznámějších onkogenů – III 5. Geny pro cykliny a cyklin-dependentní kinázy (cdk) jako onkogeny Postup buněčného cyklu u savčích buněk je koordinován aktivací cyklinů a cyklin-dependentních kináz. Z těchto důvodů jsou cykliny a některé cyklin-dependentní kinázy považovány za potenciální onkogeny. Cyklin D1 byl identifikován jako první z potenciálních onkogenů (PRAD1) stejně jako cyklin-dependentní kináza cdk4.

17. Schéma interakcí mezi cykliny, cdk-s a jejich inhibitotry během buněčného cyklu

24. ONKOGENY – význam v histopatologii Detekce produktů onkogenů, supresorových genů, antimetastatických genů popř. genů ovlivňujících lékovou rezistenci může přinést důležité informace o: • onkogenních drahách vedoucích ke vzniku nádoru • prognóze onemocnění • nejvhodnějším způsobu terapie • případné cílené genové terapii (např. antisense)

25. Antionkogeny • Nádory suprimující geny se od předchozích onkogenů odlišují tím, že kódují proteiny, které se podílejí na kontrole buněčného růstu a procesu diferenciace a ztráta jejich funkce je zodpovědná přímo za změněný fenotyp nádorové buňky. • Antionkogeny lze tedy definovat jako geny jejichž represe, inaktivace, dysfunkce nebo ztráta má za následek buněčnou transformaci. • Identifikace těchto antionkogenů byla prováděna s využitím cytogenetických studií vrozených chromosomálních změn u pacientů s nádorem, studií analýz vedoucích k lokalizaci genů zodpovědných za predispozici k tvorbě určitého typu nádorů a studií sledujících ztráty heterozygozity (LOH) nebo ztráty alel při srovnávání normální a nádorové tkáně. • Přes všechny doposud získané výsledky, molekulární mechanismy nádorové suprese pomocí proteinových produktů antionkogenů na buněčné úrovni, nejsou zcela prostudovány.

26. Retinoblastomový (Rb) gen • Retinoblastomový gen je prototyp nádorového antionkogenu, který byl objeven jako první a jeho inaktivace je klíčovým bodem ve vývoji celé řady lidských nádorů. • Je exprimován v každé buňce a existuje v různě fosforylovaných formách což závisí na stádiu buněčného cyklu. • V G0 fázi protein Rb: • nefosforylovaná forma působí jako supresor buněčného dělení • hyperfosforylováná forma ztrácí tuto svoji antiproliferační – anti-onkogenní funkci. • Molekulární účinek tohoto proteinu je založen na inaktivaci proteinů důležitých pro proces buněčné proliferace a v jádře je závislý především na interakci hypofosforylované formy Rb s rodinou transkripčních faktorů E2F. • Z předcházejících poznatků lze uzavřít, že nepřítomnost funkčního Rb proteinu, vede k uvolnění kontrolních bodů buněčného dělení a bezprostřednímu snadnému přechodu buněk do S fáze.

27. Retinoblastoma Gene Family Proteins p130 p107 Rb 1 1139 1 1068 1 H1 H2 PD-A PD-B 928 Highly conserved domains include: H1, H2 and the large pocket subdominains, PD-A and PS-B

29. p53 gen • Mezi nejčastěji se vyskytující mutace u lidských nádorů patří ty, které postihují antionkogen p53 nacházející se na chromosomu 17p13.1. • Tento gen kóduje jaderný fosfoprotein o molekulové hmotnosti 53 kDa, který je negativním regulátorem přechodu G1/S fáze buněčného dělení. • Inaktivace obou alel genu p53 byla nalezena u většiny typů nádorů a zejména u karcinomů plic, tlustého střeva a prsu. • Současný model funkce proteinu p53 je spojen s jeho aktivací vyvolanou poruchami v DNA, které jsou způsobeny různými typy záření, UV světlem nebo mutagenními látkami. • Takto akumulovaný protein se váže na specifické sekvence DNA, stimuluje expresy celé řady genů, které zprostředkovávají dva důležité efekty p53: • zastavení buněčného cyklu v pozdní G1 fázi a • programovanou smrt buňky.

30. Nuclear phosphoprotein p53 MUTATION DNA binding I II III IV V N’ C’ • Abs.: DO-1 DO-7 BP-53 CM-1 • 393 amino acids • 5 conserved regions • Very short half-life • Ab.: 1801 Lane and Benchimol 1990 Vojtěšek et al. 1992

31. Anti-p53 antibodies P+ P+ DO-1hum, mon, bov DO-2hum, mov, bov DO-7hum, mon, bov DO-11hum DO-12hum DO-13hum DO-14hum BP-53hum, mon CM-1 non-spec 421mou, hum 240 mou 1801hum, mou 1005hum, mou + P+ P+ ++ + + + P+ + + ++ + +mutant + mutant+wild +wild The end of 1994

33. Přehled některých produktů nádorových supresorů protein nádor funkce proteinu ________________________________________________________________________ p53 četné typy nejčastějších nádorů transkripční faktor pRb retinoblastom, osteosarkom regulátor transkripce NF-1 neurofibrom, gliální nádory protein aktivující GTPázu NF-2 neurinom, meningiom cytoskeletální spoj k membráně APC karcinom tlustého střeva suspektní regulátor -cateninu WT1 Wilmsův nádor transkripční faktor PTEN četné typy nejčastějších tumorů fosfatáza BRCA1 karcinom mléčné žlázy, ovarií atd. oprava DNA BRCA2 karcinom mléčné žlázy oprava DNA p16 melanoblastom, karcinom pankreatu inhibitor cdk TSC2 tuberózní skleróza protein aktivující GTPázu DPC4 karcinom pankreatu signální dráha TGF