POSIZIONAMENTO DEI NUCLEOSOMI

1. POSIZIONAMENTO DEI NUCLEOSOMI Sequenze preferenziali per la formazione dei nucleosomi Elementi di sequenza e strutturali che escludono i nucleosomi (es. elementi di confine).

2. Posizionamento dei Nucleosomi Rispetto ad una Sequenza b) Il DNA nucleosomizzato viene trattato con Nucleasi Micrococcale a) Estrazione del DNA monomerico E trattamento con R Elettroforesi Blot Ibridazione R taglia in un solo punto della sequenza monomerica Nucleosoma in fase rispetto ad una sequenza Nucleosoma non in fase rispetto ad una sequenza

3. Posizionamento Traduzionale Posizionamento Traslazionale Posizionamento rispetto ad un elemento di sequenza. La particolare sequenza può essere inclusa o esclusa dal nucleosoma Posizionamento rispetto alla fase dell’elica. La sequenza può trovarsi rivolta verso l’interno o verso l‘esterno sulla superficie del nucleosoma Il Posizionamento dei nucleosomi presenta risvolti importanti per quanto riguarda la trascrizione genica

4. Paradosso del Numero di Legame Ogni ottamero rilascia 1 giro di superelica Il DNA si avvolge di 1.8 giri intorno all’ottamero Lk = Tw + Wr La variazione del passo dell’elica spiega parzialmente il paradosso.

5. DNasiI Il nucleosoma reagisce al taglio solo su determinati siti. Periodicità di taglio = Periodicità strutturale (passo dell’elica)

6. Accessibilità del DNA nucleosomale alla DNasi I Il profilo di taglio identifica una serie definita di siti bersaglio che riflettono specificamente la geometria del nucleosoma, in particolare la disposizione del DNA sulla superficie.

7. DNasi I: analisi ad alta risoluzione La stessa tecnica si può applicare a DNA marcato e ricostituito con particelle core nucleosomali.

8. ~ 10.0bp • Ogni sito di taglio non dà una banda netta ma una piccola • famiglia di bande. • Il passo dell’elica del DNA cambia rispetto a quello che si • ha in soluzione • In media la periodicità è minore e passa da 10.5bp/giro • a 10.2-10.4bp/giro • In particolare: • All’estremità del nucleosoma il passo dell’elica è minore • (circa 10.0bp/giro) e aumenta verso il centro della • particella (circa 10.7bp/giro) • Questo spiega in parte il Paradosso del Numero di Legame • in base all’equazione ΔL = ΔT + ΔW ~ 10.7bp ~ 10.7bp ~ 10.0bp

9. H1 e la formazione di strutture di ordine superiore

10. Secondo Livello: Fibra da 30nm COME SI PASSA DALLA FIBRA DA 10nm ALLA FIBRA DA 30nm?

11. La Cromatina è composta di particelle discrete Cromatina che fuoriesce da nuclei lisati: fibra da 30nm Cromatina trattata con nucleasi micrococcale: fibra da 10nm

12. 1 mM 5 mM Cromatosoma C N H1 H3 H3 Il complesso di un nucleosoma con l’istone H1 è chiamato “cromatosoma” e contiene 168bp di DNA + ottamero istonico + istone linker H1 L’istone linker verosimilmente dirige il posizionamento relativo di nucleosomi successivi e il profilo dei contatti nucleosoma-nucleosoma

13. L’istone linker: H1 H1: FAMIGLIA ISTONICA Nel Topo: H1° espresso nello sviluppo H1t specifico del testicolo H1b coinvolto nell’apoptosi indotta da raggi X • Le funzioni dell’istone H1: • Stabilizzare la fibra da 30nm (punto ancora controverso); • Minimizzare lo slittamento nucleosomale; • Cambia la ripetizione nucleosomale; • Effetti sull’attività trascrizionale. Il legame di H1 al nucleosoma è altamente dinamico. Modello STOP-AND-GO: H1 viene continuamente scambiato. Questo suggerisce che esso deve contribuire alla dinamica di folding-unfolding della fibra.

14. Modello folding-unfolding della cromatina e ruolo di H1 Non c’è formazione di fibre spesse organizzate bene L’alta concentrazione salina aiuta gli istoni del core nelle interazioni nucleosoma- -nucleosoma “Collana di perle” Nucleosomi aggregati Si formano strutture ordinate da 20nm e 30nm 20nm 30nm H1 si dissocia Hizume K. Et al. (2005) Biochemistry 44, 12978-12989

15. Analisi geometrica di immagini ottenute in AFM Le fibre di cromatina mostrano diversi stati conformazionali che dipendono da sottili cambiamenti nell’ambiente circostante

17. Emergono due possibili classi di modelli per la fibra da 30nm: • Elica solenoidale (tecnicamente definita one-start), in cui i nucleosomi • sono avvolti in maniera lineare. • Evidenze a favore di questo modello: • a) Diametro invariante rispetto alla lunghezza del DNA linker • b) Aumentato compattamento per fibre con 6 o più nucleosomi • c) Necessità di un DNA linker superavvolto • (Robinson et al., 2006) • Nastro a zig-zag (definito two-start), in cui il nastro si piega e si • superavvolge. • Evidenze a favore di questo modello: • a) Variazione del diametro della fibra al variare del linker • b) Percorso a zig-zag dei nucleosomi • c) DNA linker non strettamente piegato • (Schalch et al., 2005)

18. One-start: modello solenoidale della fibra da 30nm Polinucleosomi ricostituiti con lunghezze variabili del DNA linker Condizioni saline fisiologiche Presenza dell’istone H1 Tecnica della microscopia elettronica L’approccio non fornisce informazioni precise sul percorso del DNA linker ma la costanza delle dimensioni suggerisce che esso sia ripiegato all’interno della fibra in maniera continua e regolare. La compattazione è migliore in presenza dell’istone linker

19. Two-start helix: modello a zig-zag della fibra da 30nm Tetranucleosoma ricostituito analizzato con la diffrazone alla risoluzione di 9Å LS: linker dritto LB: linker piegato La presenza di due differenti conformazioni del linker suggerisce che il dinucleosoma possa rappresentare meglio l’unità ripetitiva della struttura di ordine superiore Le analisi su questa struttura favoriscono il modello a zig-zag per il DNA linker. Non definisce chiaramente il ruolo dell’istone linker.

20. In Xenopus laevis l’istone B4 è l’unico istone presente nell’uovo e viene Rimpiazzato da sottotipi somatici di H1 (H1A) in concomitanza con l’attivazione genica zigotica. L’effetto repressivo di B4 è più debole di quello di H1 somatico. B4 potrebbe contribuire direttamente alla dinamicità della cromatina nell’embriogenesi precoce. B4 differisce da altre varianti per la composizione del tratto C-terminale e la sua basicità è anche ridotta. Questo aspetto viene studiato utilizzando un metodo di assemblaggio della cromatina che fa uso di NAP-1 (nucleosome assembly factor-1), una proteina chaperone per gli istoni H2A e H2B, ma che viene dimostrata funzionare anche come chaperone per B4 e H1A.

21. Accessibilità alla DNAsi del dinucleosoma ricostituito H1A protegge il DNA linker dalle nucleasi al contrario di B4, quindi la struttura è più compatta. Entrambi, come atteso, legano il nucleosoma al livello dell’asse diadico. Quindi B4 non riduce l’accessibilità del dinucleosoma e permette quindi un più facile rimodellamento della cromatina.

22. NAP-1 funziona come chaperone e come scambiatore che facilita il Reclutamento di complessi di remodeling che modulano regionalmente l’istone linker nel nucleo

23. H1 ha un ruolo importante ma NON è il maggiore determinante della struttura della cromatina Le cellule compensano la perdita di H1 attraverso maniere alternative di condensare il DNA, ad esempio: Tetrahymena senza H1 presenta nuclei allargati e cromatina meno condensata; Topo senza H1 presenta l’aumento del numero di ottameri istonici e la diminuzione del DNA linker. H1 mostra quindi una grande importanza nello stabilizzare piuttosto che nel formare la fibra da 30 nm. Perciò la condensazione potrebbe non richiedere l’associazione permanente di H1 con la cromatina.

24. Interazioni nucleosoma-nucleosoma Le interazioni elettrostatiche tra nucleosomi contribuiscono grandemente alla compattazione della fibra cromatinica. La coda N-terminale di H4 di un nucleosoma interagisce con gli istoni H2A del nucleosoma successivo I residui 14-19 sono fondamentali e in particolare la K16 K16 acetilata destabilizza i contatti nucleosoma-nucleosoma H2A contiene un “acidic-patch” che è responsabile dell’interazione Questo può variare suggerendo un ruolo regolativo di H2A

25. Dinamicità della cromatina • Nonostante la stabilità del nucleosoma e dell’alto grado di compattezza nel nucleo • la cromatina è sorprendentemente dinamica. • Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle necessità della • cellula di regolare i processi biologici dall’espressione genica, alla riparazione • del DNA, alla replicazione e ricombinazione. • Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3. • Modificazioni epigenetiche degli istoni: acetilazione, metilazione ed altre. • Uso di sistemi di rimodellamento che cambiano la stabilità e/o la posizione • del nucleosoma.

26. VARIANTI ISTONICHE S viene fosforilata in seguito a danni al DNA §: differenze in questo loop prevengono l’assemblaggio di un nuc. contenente H2A e H2A.Z #: questo dominio contatta (H3-H4)2 e variazioni qui influenzano la stabilità del nucleosoma. # § Le varianti istoniche sono coinvolte in vari processi, sia nella espressione genica, sia nella riparazione del DNA, sia nella definizione di strutture eterocromatiche.

27. H2A.Z • In lievito: • è richiesto per l’espressione di circa 200 geni • limita l’espansione dell’eterocromatina costituita dal complesso SIR • In mammifero: • promuove la formazione dell’eterocromatina (altera la superficie del • nucleosoma per promuovere il folding mediato da HP1a- Fan J.Y. 2004) • In Drosophila: • H2Av = H2A.Z, si localizza sull’eterocromatina e promuove il silenziamento • genico H2A.X Questa variante è coinvolta nella riparazione del DNA. Appare nei nucleosomi fiancheggianti le rotture a doppio filamento. Funziona come marker per lesioni al DNA H2ABbd (Barr body deficient) In questa variante la natura acidica è ridotta. È ampiamente assente dai Corpi di Barr. macroH2A Arricchito nei corpi di Barr e coinvolto nell’inattivazione del cromosoma X

28. SCAMBIO DELLE VARIANTI ISTONICHE NELLA CROMATINA Gli istoni e le loro varianti possono essere scambiate in un processo mediato da proteine. Ad esempio lo scambio del dimero H2A-H2B avviene regolarmente con il procedere della trascrizione: • RNA polimerasi II può da sola spiazzare il dimero H2A-H2B • FACT (Facilitates Chromatin Trx) spiazza H2A-H2B • Spt6 aiuta il riposizionamento di dimeri H3-H4 • Dati per lo scambio di H2A.Z nella trascrizione: • In lievito H2A.Z viene depositato preferenzialmente nei promotori, quindi avrebbe • un ruolo positivo nella trx (Larochelle, 2003) • H2A.Z viene spiazzato nella regione interna trascritta (Farris2005)

29. Chaperone istoniche mediano lo scambio tra istoni e varianti istoniche • NAP-1: • Facilita il legame di fattori di trx rimuovendo il dimero H2A-H2B • Può rimuovere o rimpiazzare H2A da nucleosomi ricostituiti • Aiuta lo sliding dei nucleosomi rimuovendo transientemente H2A-H2B • Si trova spesso associato al dimero H2A-H2A.Z e scambia anche questo • HIRA: histone regulatory homolog A • e • ASF-1a : anti silencing function 1a • incorporano macroH2A nei foci di eterocromatina associati alla senescenza • HIRA incorpora anche H3.3

30. Nuovo complesso SWR1 dedicato alla variante H2A.Z: Promuove esclusivamente lo scambio H2A.Z-H2B H2A-H2B Contiene molte subunità presenti anche nel complesso NuA4 (Act1, Arp4, Rvb1, Rvb2, God1, Vps72, Yaf9) SWR1(lievito) Tip60(mosca) NuA4 Swr1 Domino Tip60 HAT = Esa1 I RIMODELLATORI DELLA CROMATINA ATP-DIPENDENTI SONO IN GRADO DI MOBILITARE GLI ISTONI Swi/Snf Rsc ISWIb Catalizzano lo scambio di H2A-H2B in maniera ATP-dipendente SWR1

31. H2A.X gH2A.X è una variante che fosforilata interviene nella riparazione dei danni al DNA. Riconosciuta dal complesso INO80 di lievito che contiene un’ATPasi simile a Swr1. Anche NuA4 e Tip60 (in mammifero e Drosophila) hanno un ruolo nel riparo di DSB e nel riconoscimento e/o eliminazione di gH2A.X H2Av In Drosophlila, combina caratteristiche di H2A.Z e H2A.X nella regione C-terminale. Anche esso si trova nelle vicinanze dei siti DSB dTip60 acetila la forma gH2Av (o nucleosomi che la contengono) e lo scambia con H2Av non fosforilato.