第八章基因工程（ GENETIC ENGINEERING ）

第八章基因工程（GENETIC ENGINEERING）

本章，我们讨论4个问题： 1. 什么是基因工程——基因工程的概念。 2. 为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。（包括3大理论和3大技术准备） 3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理） 4.基因工程的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。

第一节概述 一.现代科学技术发展的3个特点：（一）科学技术加速发展和急剧变革： 1.当代科学发展成指数增长趋势，全世界发表科技论文6000－8000/天，平均1篇/10.8秒问世。 2.人类科技知识在19世纪半衰期是50年，现在是3－5年（终身教育学习）。 3.1973年，Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状的转移terr+nersr→terrner，导致基因工程技术诞生，至今不到30年，人类已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。（克隆羊多利1997－2003，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）

tetr ner Psclol Rb-3 sr tetr tetr ner tetr ner O ne 图8-1 Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状转移示意图

(二)科学技术发展的综合化 1.19世纪中叶，以科学技术是分离的，它们各有独自文化传统，它们的发展往往是脱节的。 2.科学回答“是什么”“为什么”，技术回答“做什么”“怎么做”。当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体现科学。 3.当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。突破是线性的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有一代科技成果。融合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。基因工程既是科学又是技术，既是突破，又是融合。她造成革命性市场（美国基因工程产品300亿美元/年，乙肝疫苗50美元/人）；她是分子遗传学，生物化学，细胞学，细胞生物学，分子生物学相互渗透，交叉融合、突破的结果。

(三)科技发展必需和人文社会科学发展相结合： 1.当代各种全球性问题出现，从一定意义上来说是由于科学技术广泛应用于社会而引发的，如TMD、NMD(布什对萨达姆) 2.科学技术是第一生产力，而文化水平是人类把握科学技术的一个尺度。 3.科学技术是一把双刃剑，原子核技术可以给人类带来光明，原子弹却可以把长崎、广岛夷为平地；克隆技术，基因工程技术可以挽救濒临灭绝的动物（国宝熊猫），也可以动摇人类以性爱为基础的生产方式……（冷冰冰克隆人和自然人，×情人节少了一个经济增长点；克隆战争狂人和反战英雄；克隆idea孙悟空齐天大圣）。基因工程技术是当代科学技术重要的前沿。

二．基因工程的概念 （一）基因（gene）基因从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。（二）基因工程（genetic engineering）基因工程在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。

在这个过程中： 1.“基因剪刀” 剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起 3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK→抗癌）。

我们应该记住他们—— 1.第一个实现DNA重组的人－Berg 1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。 2.第一个取得基因工程成功的人－Cohen 1973年，Cohen Group将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。

三．基因工程克隆技术――人类对自然的干预 （一）遗传和变异是生物学的一对重要概念。 1.遗传赋予生物种的稳定，保证生物种的延绵不断（不能断香火）。 2. 变异赋予生物种的进化，保证生物种对环境的适应。 3. 遗传和变异这一对矛盾在一个生物体内统一起来。 4.在生物演变的历史长河中，自然发生的变异是相当相当缓慢的。 5.随着生物科学的发展，尤其是基因工程技术的诞生，人类开始干预生物的变异（福耶祸耶？无法定论） 6.经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手段几十年乃至几年就可以实现。而时至今日，几乎一发不可收拾。

(二)多利 1997．2．23．，Nature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫多利的绵羊（1997－2003/7/12）。这一消息的公布，全世界震惊的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸，在全球引起了轩然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯狂！为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年动物乳腺细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一条上百年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。

（三）多利诞生的过程 为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。多利诞生的过程： 1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。 2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。 3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。

（四）此克隆非彼克隆 胚胎细胞克隆体细胞克隆供体细胞胚胎细胞（核）体细胞（核）受体细胞去核未受精的卵细胞去核未受精的卵细胞发育场所母体宫腔母体宫腔关键区别克隆的是子代（多生了一个）复制的是自己（复制了一个）（五）克隆是一把双刃剑试想，有了克隆技术，有人在你毫不知晓的情况下复制一个“你”去犯罪，怎么办？试想，有了克隆技术，一些极权的政治野心家一下子克隆出好几个战争狂人希特勒、墨索里尼，怎么办？还有，有了克隆技术，世界上同时生活着多个你、我、父母、兄弟、姐妹，按现行的社会伦理道德很难为其“名份”定位，又该怎么办？因此说克隆对人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战，平添一系列是我非我、是父非父、是妻非妻、是子非子之类的麻烦事，绝非危言耸听。从社会伦理角度看，用克隆技术培育出的人，有其特定的生理性状，这对人类的自然发展和人种的自然构成无疑会产生极大的影响。

从家庭伦理角度看，将克隆技术用于人体繁殖，会加剧家庭多元化倾向，还会从根本上改变人的亲系关系，确定人类亲系关系的标准也将发生改变。从家庭伦理角度看，将克隆技术用于人体繁殖，会加剧家庭多元化倾向，还会从根本上改变人的亲系关系，确定人类亲系关系的标准也将发生改变。从性伦理角度看，它完全改变了人类自然的基于性爱的生育方式，使人口的生产与性爱分离，从而破坏男女之间基于性受而获得后代的情感，并由此改变人类的基本性伦理关系。从遗传学上看，人本来是由两性细胞结合而产生的，这种结合有利于人种进化，而克隆使人的遗传基因成为单一的，势必导致人种退化。从哲学上看，克隆还会使人们正常的生与死的概念发生动摇。图8-2 用克隆技术复制人类的假想图

四．基因工程3大理论，3大技术准备： （一）理论上的3大发现： 1. 20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。 2. 20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。 3. 20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→Pr,破译了全部遗传密码，43。

（二）技术上的3大发明： 1．“基因剪刀”－限制性内切酶的发明（1）20世纪40－60年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。

2．载体(“交通工具车子”)－基因工程技术诞生的第二个技术准备（1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子（富康）将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。

3．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下）3．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下） (1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNA→cDNA (complementory DNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。

五．与基因工程相关的概念： （一）克隆（clone,cloning）： 1.原意是指单细胞纯系无性繁殖。 2.现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecular cloning）。 3.这个术语的几种含义：（1）作为名词 ①带有相同插入顺序的重组DNA分子的1个群体。 ②基因型（genetype）相同的细胞或生物体的一个群体。 ③最常用的是描述一个微生物的一个菌落，这些微生物带有插入了特定DNA片断的载体分子。（2）作为动词，是“去克隆”，即利用体外DNA重组技术将一个特定的基因或DNA顺序插入一个载体分子。

（二）重组DNA技术(DNA recombination technique) 是用酶学的方法将不同来源的DNA在体外切割，连接组成一个杂合的DNA分子的技术。基因工程包括DNA重组技术，现将相关的概念关系列表如下。（三）生物工程（Biologic engineering）：是更大范围内生产及产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包括： 1.遗传工程（genetic engineering）比较基因工程有更广泛的内容，包括基因工程，但基因工程不等于遗传工程，凡是人工改造遗传性状的技术都称之遗传工程，有个体的，细胞的，分子水平的。（1）基因工程：①DNA重组；②DNA体外诱变； ③体外基因操作； ④基因化学合成等。（2）物理化学诱变；（3）细胞融合（4）花粉培育（5）有性杂交等。 2．发酵工程 3．酶学工程 4．细胞工程 5．农业工程 6．希望工程

第二节工具酶 常用的工具酶（tool enzymes）有： 1.限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease) 2.DNA连接酶（DNA ligase,ligase) 3.逆转录酶(reverse transcriptase) 4.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol) 5.核酸酶(nuclease) 6.末端转移酶(terminal transferase) 7.碱性磷酸酶(BAP或CIP) 以1. 和2. 最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。

一．限制性核酸内切酶 （一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正关系） 1.定义限制酶（restriction endonuclease,restrction enzymes）是一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。所谓限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键） 2.分类限制酶都是从原核生物中发现的（400多种E/350M）。所有的限制酶可分成3类。（1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说Ⅲ型识别核切割的位点一致，但罕见）。（2）Ⅱ型基因工程说到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此类酶的微生物限制－修饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2＋作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段。

3.命名（1973年Smith 原则、Ⅱ型酶） 根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名前的2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R株分离得到的第一种限制酶。

(二)限制酶的识别位点 1．一般特征（4点）：（1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。（2）它能识别dsDNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。（3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如： GC CG GTNAC GAA TTC Hha CG GC MaeⅢ CANTG EcoRⅠ CTT AAG (4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于： ①要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256 ②同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。

2.识别简并序列; 简并序列是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如： GTYRAC Y=C或T R=G或A YR=CG或CA或TG或TA Hin Ⅱ实际上可以识别4个特定序列。 3.识别位点与切割位点不同，但二者距离是一定的(某些酶识别位点在切割位点附近),即产生特定的DNA片段，这是与Ⅰ型酶的区别之一。 HgaⅠ 识别位点GACGC→5/10(核苷酸距离)→dsDNA上切割 5ˊ GACGC NNNNN↓ NNNNN 3ˊ 3ˊ CTGCG NNNNN NNNNN↑ 5ˊ 先识别（搞清楚）滑行一段距离再切，此称为Distant cleavage

(三)限制酶的切割位点： 限制性对dsDNA 2条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生3种不同切口： 1．形成平头末端（flush或bluntend）如－TC↓GA-smaⅠbsuRⅠ or –TC3ˊ+5ˊGA- －AG↓ CT-AluⅠ -AG5ˊ+3ˊCT- 2.形成5′－粘性末端（5′－cohesive end即3′延伸末端） 5′-GAATTC3′EcoRⅠ 5′-G AATTC-3′ + 3′-CTTAAG5′ 3′-CTTAA G-5′ 3.形成3′－粘性末端（3′－cohesive end） 5′CTGCAG 3′ pstⅠ G-3′ 5′-CTGCA + 3′GACGTC 5′ ACGTC-5′ 3′-G 粘性末端（sticky end）—限制酶切割产生2个突出的末端称之，作用是放在一起自发形成双链。

（四）同裂酶(isoschizomers) 通常不同的酶识别不同的顺序，然而有许多不同源限制酶产生相同的末端，此即同裂酶。 1．异源同工酶（Isoschizomers:来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同： (1)识别顺序与切割方式同，如： MboⅠ 5′和SauSⅠ 3′（－NN↓GATCNN-3′）-NNCTAG↓NN-5′ (2)识别顺序同，切割位点不同，如： SmaⅠ和XmaⅠ CCC↓GGG C↓CCGGG (3)识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰”（甲基化*），另一酶不能。如： HpaⅡ→CCGG MspⅠ→CCG*G MboⅠ→GATC Sau 3A→GA*TC 2.一个位点包含在另一个位点之中（称subsets-识别与切割相互有关的酶称之。） HpaⅡ CC↓GG SmaⅠ的6个bp含HpaⅡ的4个bp顺序，所以HpaⅡ SmaⅠ CCC↓GGG 能识别与切割SmaⅠ的6个bp，但含有HpaⅡ的ccgg其它6核苷酸顺序都不能被SmaⅠ切割。 3．同尾酶（isoaudumers-识别顺序不同，产生粘性末端相同的酶称之。） BamHⅠ G↓GATCC 由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，Sau 3A N↓GATCN 在DNA重组时具有更大的灵活性。

(五)限制酶得正常识别切割能力是buffer的或几个因子的函数（1－8等）(五)限制酶得正常识别切割能力是buffer的或几个因子的函数（1－8等） 1.酶浓度 2.酶的专一性 3.离子浓度 4.pH 5.温度 6.底物浓度、纯度 7.2价离子：Mg2+、Mn2+、Co2+、Zn2＋8.保护剂：甘油、DMSO、甲酰胺 Polisky证明，Mgcl2从5mM下降至2mM，pH值上升到8.5，EcoRI专一性从6bp下降至4bp即NAATN,这种识别AATT的EcoRI称EcoRI*。一种限制酶可能被它识别位点的甲基所抑制，这对于组建DNA甲基化图谱是很重要的，是研究一个动向。对于限制反应机制，尽管书上列出1，2步反应，但人们更关注他的应用。所以这方面资料极少（全球1－2人）。（六）限制酶的应用： 1．DNA重组 2.分子杂交受体体段DNA 3.DNA 序列分析 4.制备DNA指针 5.基因定位,DNA 7.DNA甲基化碱基的识别和切割 8.组建新质粒

DNA物理图谱——标明限制酶在DNA分子上的限制位点数，限制性片段的大小及排列顺序的图谱称之或称限制性图谱。组建图谱是基因工程的第一步工作（很难，拿来主义多，受惠赠，千万注意要图谱，不要受骗），与基因定位，转录，消化，分离，分子杂交，克隆转化有直接的关系。

二．DNA连接酶： DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNA ligase. （一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。（二）来源－噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子；（2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）

三、逆转录酶 （一）概述逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA聚合酶（RNA dependent DNA polymerase,RDDP）。是由Baltimove从鼠白血病病毒（murine leukemia virus,MLV）和Mizutan从劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)中，于1970年分别各自发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可见其意义。该酶在逆转录病毒（retro virus）生产循环中起主宰作用。（二）功能基因工程中主要用于逆转录mRNA→cDNA（complementory DNA）。（三）商品化逆转录酶有两种①AMV（禽成髓细胞瘤）②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。

（四）酶的活性 由于尚不完全清楚原因，sscDNA能形成发夹结构，引导Ecoli DNApolⅠkelnow片段或录酶合成cDNA第二条链，（多年来除了自身引导合成cDNA第二条链外别无它法）。逆转录酶是一种多功能酶，它的酶活性有： 1.逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA 2.DNA依赖DNApol 以ssDNA为模板，3′－OHDNA片段为引物，按5′→3′合成DNA链。 3. RnaseH 外切RNA酶活性，底物是RNA－DNA杂交分子RNA链，有两种： ①5′→3′外切RNA，称5′→3′外切RNA酶； ②3′→5′外切RNA酶，称3′→5′外切RNA酶，也称RnaseH。 4.DNA内核酸酶 Mn2＋存在时，逆转录酶能切cccDNA，此活性无专一位点，对热不稳定。 5. DNA解旋酶类似unwinding。

四、DNA聚合酶： DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA，基因工程常用的酶有：（一）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coli DNA polⅠ） 1956年，A.kornberg首先从E.coli中分离得到。是由1条多肽链组成的球蛋白直径65，MW109KD，并以蛋白敏感的多肽接头折叠成两个区域含19－45％а螺旋结构，分子中有单链巯基，每分子含1个Zn2＋原子，还不能证明Zn2＋参加了催化反应，酶活性中心有3个密切相连的结合位点－即DNA核模，核苷磷酸（估计引物，生长链痘结合在这里）和dNTP结合位点。 1．E.coli DNA pol由大小两亚基组成，具有3种酶活性，即大亚基5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶及小亚基的5′→3′外切酶活性：（1）5′→3′DNA聚合酶活性以ssDNA为模板，沿引物3′－OH方向，按模板顺序从5′→3′延伸。 5′CCGATA－OH E.coli DNA polⅠ 5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA5′ Mg2＋dDNP 3′GGCTCGGA 5′ （2） 3′→5′外切酶活性即从游离的3′－OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意义在于识别和消除不配对的核酸，保证DNA复制的忠实性。其dsDNA外切活性可被5′→3′聚合活性所抑制。 5’CGCATCG-OH 3’ E.coli DNA polⅠ 5’CGC 3’ GCG Mg2＋3’ GCG ＋dAdTdCdG 其dsDNA外切酶活性可被5′→3′DNA聚合酶活性所抑制。（3）5′→3′外切酶活性：从游离的5’端降解dsDNA成单核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA杂交体RNA成分（具有RnaseH活性） 5’－CTCATTAG－3’ E.coli DNA polⅠ 5’－CATTAG 3’－GCGTAATC－5’ Mg2＋ 3’－GCGTAATC +pC,pG

2. E.coli DNA polⅠ(DNA polⅠ)在基因工程的应用： （1）制备高比活性的探针 DNA polⅠ可催化DNA缺口移位反应（Nick translation），为基因工程制备高比活性放射性探针（放标，非放标，32P，地高辛6400.00/盒） 5’――――――――3’ 3’――――――――5’ dsDNA Mg2＋ ↓DNA酶Ⅰ 5’ —3’ （3’—5’）↓32P dNTP,DNA polⅠ（全酶） 5’―3’ 3’―5’ （参缺口平移法图解）（2）用于分子克隆（填充缺口利于重组） DNA polⅠ能填充DNA的小缺口区（Gapped region）→以便有效在体外用于DNA分子重组，如： ①切割cccdsDNA分子作载体时 ②插入一段不具粘性末端的DNA片段或加入1个同源顺序ssDNA片段 ③此时用DNA polⅠ填充这个缺口 ④再用ligase(3’-OH,P-5′)连接，组成重组DNA分子。

（3）DNA序列分析 DNA polⅠ是3种测测序法（Sanger双脱氧法（测序自动化原理同Sauger双脱氧法），化学降解法和加减法）中的关键试剂→每个方法的成败都取决于DNA polⅠ从融合引物复制的ssDNA的能力（详参DNA的序列测定），这里仅作简介。 ① Sauger双脱氧法 DNA polⅠ参入了2’3’－双脱氧核苷酸到相应的融合了的引物中，从而终止了链的进一步延伸，这样每个大小不同片段都带有ddNTP。经过PAGE测出DNA顺序。 ② 化学降解法当Mg2＋被Mn2＋取代时，DNA polⅠ有参与相应NTP取代dNTP的能力，参与的这个NTP可以作为1个特殊切割位点而被降解，得到带有NTP末端的DNA片段，这是化学法测序的主要原理。 ③ 加减法主要原理是在限制使用dNTP条件下加入DNA polⅠ和T4诱导的DNA pol同时反应。在减法反应中从4个反应混合物中每4个dNTP中减去1个。生长链沿着引物延伸至缺少的那个dNTP为止。在加法反应中所用的dNTP只有1种，如dATP，通过DNA pol 3′→5′外切酶活性使链终止在带有A的3’末端用其它3种dNTP进行类似反应，这样通过加或减法8个混合物的电泳结果即可推出DNA链的顺序。

（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶基因工程很多情况下，E.coli DNA polⅠ可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。该酶是枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coli DNA polⅠ所得到的。 1.Klenow大片段是一条多肽链，MW76KD，保留了E.coli pol Ⅰ 的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。 2. Klenow在基因工程用于： (1)补平用限制酶消化dsDNA得到的5’粘性末端（即3’延伸末端） 5’－G-OH Klenow, Mg2＋ 5’－GAATT 3’－CTTAA Dntp 3’－CTTAA (2)同（1），填平过程中，用32p dNTP标记DNA片段3’末端。 (3)cDNA克隆了中，用于合成cDNA的第二条链。 (4)在Sanger双脱氧法 ddNTP系统进行序列分析。

（三）T7噬菌体DNA聚合酶及测序酶: 1.T7噬菌体DNA聚合酶（1）来源T7噬菌体感染的E.coli诱生的DNApol是两种蛋白的复合物（T7噬菌体基因蛋白和宿主硫氧还原蛋白的紧密复合体）。（2）酶的活性与Klenow片段（酶）相似，有5’－3’聚合活性以及3’－5’外切酶活性，无5’－3’外切酶活性。 ①5’－3’聚合活性其5’－3’聚合能力和合成DNA平均长度较目前已知的其它任何DNA pol 都强（持续聚合能力强）。可用于拷贝长段模板的引物延伸反应。 ②3’－5’外切酶活性较Klenow酶强1000倍，其用途与Klenow酶一致，不同的是在于可对3’突出端的DNA分子进行末端标记。 2．测序酶是经过基因工程改造的T7噬菌体DNA pol，它完全丧失了外切酶的活性，故该酶是Sanger双脱氧法对长片段DNA进行序列分析的理想用酶（商品名即测序酶）。

（四）TaqDNA聚合酶(Taq DNA pol，Taq pol） 该酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5’－3’聚合活性以及依赖5’－3’聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最适反应温度是75℃－80℃,37℃ 活性有10％。该酶的主要用途是进行PCR反应（详参聚合酶链，polymerase chain reaction） 1.来源 1969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真菌，即水生栖热菌株（thermus aquaticus strain,TYC），该菌能在70℃－75℃生长，已经克隆化该菌的基因，cetus公司首次分离纯化了该酶，商品名为Taq DNA polymerase，分子量94KD，－20℃至少可贮存6个月，由于Taq DNA polymerase能抵抗链分离所需要的高温（94℃－95℃）的反复处理，故只需在第一次热变性后，加一次酶，即可以进行30－40次循环，简化加快了操作程序，实现了PCR的自动化，耐热酶还有VENT、sac等，以Taq应用最广。

2.使用Taq pol主要考虑下述5个参数（PCR） （1）热稳定性 PCR cycle中，DNA变性处理通常30－60秒，按30个循环累计热变性时间为15－30分钟，Taq pol连续保温30分钟后，仍保持相对高的活力。（2）特异性退火（复性）和延伸的温控对引物模板的转移性影响很大。Taq pol最是反应温度是75℃左右，而退火温度可在55－70℃，因而Taq pol可显著提高引物退火特异性，避免了引物与模板非特异性产物的合成。（3）延伸长度 PCR有时需要扩增>1kb的片段，这就要求选用DNApol具有较强的延伸能力。当扩增片段>250bp时，使用Klenow片段时的扩增率大为降低，而Taq pol能从基因组扩增2kb片段。

（4）合成产率高据酶反应动力规律，聚合反应后期会产生平台效应，平台期出现时，合成产物积累多少，直接与DNA pol的性能有关。用Taq pol平台期在25轮循环时出现，产物累计达1×107拷贝，高于Klenow片段。（5）忠实性评价一个DNApol的忠实性在于检测复制过程中核苷酸错误掺入的频率，酶的忠实性是一个关键特性，尤其是PCR扩增物进行DNA序列分析时就显得尤为重要。 Klenow片段错误频率约为1/10000,Taq pol约为1/5000，实际应用中，Taq pol经过25轮循环中，延伸产物的任何位点将在400碱基中出现一个分子篡改原始序列。目前已发现T4DNA pol的忠实性较上二者好，其碱基错误掺入频率<107。现国外已建立Taq酶克隆菌株，能改进上述性能，增加产量，提高产率。

（五）T4噬菌体DNA聚合酶（T4 DNA pol） 1.来源源于T4噬菌体感染的E.coli。 2. 酶的活性，相似于Klenow片段，但远远强于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ聚合活性（2）3ˊ→5ˊ外切酶活性（T4 pol/Klenow） 3.基因工程中用途与Klenow片段一致（参前，标记末端，填平5’末端），不同的是可对3’突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，产生3’凹端。 5’－CTGCCTGCA—3’ T4DNA pol 5’－CTG 5’-CTACC 3’-GACGG 32P-dCtp,dNtp 3’－GACGG 3’-GACGG

五．核酸酶 常用的的单链特异的SI核酸酶（核酸酶SI,nuclease SI，SI）和BAL31。（一）核酸酶SI(SI核酸酶，nuclease SI，SI，常用的核酸酶) 1.来源源于米曲霉素（aspergillusoryzas） 2.酶作用底物 ssDNA、ssRNA、dsDNA、或DNA-RNA杂交链。 3.酶活性有低、中、极高3种情况变化－ (1)降解ssDNA或ssRNA形成5’p末端的单或寡核苷酸，对DNA活性强于>RNA,如： ssDNA或ssRNA SI，PH4,5 Zn2＋5ˊpdN 或5ˊprN (2)中量SI可从切口（Nick）或小缺口（small gaps）处降解dsDNA， (3)极大量的SI才能讲解dsDNA或DNA-RNA杂交链，原因是后者对SI讲解有抗性，所以SI又称单链特异的核酸酶。在基因工程中用于： ①去除DNA片段的粘性末端而产生平端。 ②打开cDNA中的发夹环，使其成平端。 ③分析DNA：RNA杂交体结构，可证明基因内部内含子的存在（当一条DNA与它的mRNA杂交时，如果杂交链中有RNA－loop环，SI可切开这个环，这是基因中有间隔顺序证明。

(二)BAL31核酸（源于乳白短杆菌） 1.来源乳白短杆菌。 2.酶活性 3’外切核酸酶活性和内切核酸酶活性。 3. （1）3’外切核酸酶活性：底物平端dsDNA或dsDNA切口；3’－OH突出端或ssDNA；dsRNA。（2）内切核酸酶活性：DNA的单链区；底物DNA螺旋构象有所改变的双链区。 4．基因工程用于：（1）通过可控方式去除dsDNA末端的核苷酸→用于基因克隆表达、缺失突变等。（2）与限制酶协作→建立物理图谱。（3）确定DNA的二级结构→如z－DNA与b-DNA的结合部位等。

六、末端转移酶（TTE） （一）来源小牛胸腺。是仅存于前淋巴细胞及淋巴样细胞内的一种不同寻常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3’－OH末端，也称末端脱氧核苷酰（酸）转移酶（terminal transferase，TTE）。（二）底物带3’－OH末端的ssDNA具有延伸3’-OH末端dsDNA或平端dsDNA的作用。（三）酶活性： 1. 催化一个单核酸（dNTP）－>加到另一个DNA分子的3’－OH末端，如： ssDNA－OH TTE，Mg2＋或Mn2＋DNA－pd（N）n＋ppi ndNTP 2. 平端或带延伸3’－OH末端的dsDNA需要Co2＋存在才能作模板，如： dsDNA TTE Co2＋DNA－pd（N）n＋nppi ndNTP （四）基因工程中用于： 1．加一个互补同源多聚尾－>到载体和cDNA－>造成便于重组的人工粘性末端。 2.在32p存在时，用于标记DNA分子的3’末端。

七、碱性磷酸酶（alkaline phoptase, APE） APE包括BAP（细菌碱性磷酶和CIP（小肠碱性磷酶）。功用如下：（一）去除DNA、RNA和dNTP的5ˊ磷酸根。（二）去除5ˊ-P，防止DNA片段或载体自身环化。（三）32p标记5ˊ—末端前，先用其去除DNA或RNA上的5 ˊ-P。

几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用

第三节载体 一．载体的概念： 1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。 3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA

二、载体的分类 √

说明： 1.穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间，如：YEP,DIDB219 2.YACYeast Artificial Chromsome 由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成，对克隆大的真核基因十分有用，在HGP中发挥主要作用。 3.BAC细菌人工染色体。

第八章基因工程（ GENETIC ENGINEERING ）