Bio 4600, uke 35/36, 2003 Kloning og mutagenese

1. Bio 4600, uke 35/36, 2003 • Kloning og mutagenese • Struktur og Funksjon av Immunoglobuliner analysert ved hjelp av In Vitro Mutagenese. • Subkloning • QuickChange Mutagenese • PCR Soeing (Splicing by Overhang Elongation)

2. Antigen binding Binding til reseptorer Fv VL VH Fab CL CH1 CH2 Fc CH3

4. J J IgA IgM

5. HindIII -800 1 Inserted BamH1 1891 Inserted Mlu1 site 1069 The red arrow indicates an HindIII/BamH1 insert of genomic DNA. The IgA gene is preceeded by 800 bp of unknown sequence. Enzymes that do only cut once in IgM wild type gene are indicated in blue. In addition we have insetred an Mlu1 site at position 1069 that is not found in the wt sequence.

6. HindIII -1200 Xba1 -1180 BamH1 Inserted Mlu1 site1552 The blue arrow indicates a HindIII/BamH1 flanked insert of genomic DNA. The IgM gene is preceeded by 1200 bp of unknown sequence. Enzymes that do only cut once in IgM wild type gene are indicated in blue. In addition we have inserted an Mlu1 site at position 1552 that is not found in the wt sequence. In red, two unique Sma1 sites of the the IgM wt gene are indiated.

8. pUC19 med IgA 3,4Kb Fragment av IgA gen 1-1891 Start ca 800bp fra HindIII (Sekvensen til disse 800 baseparene er ikke bestemt) Størrelse IgA HindIII:BamH1 innskudd ca 2700 basepar (Størrelse puC19 2686) BamH1 HindIII Mlu1 5’ 3’ C1 C2 C3 pUC 19 base 1 pUC 19 med IgM gen 6,4 Kb Fragment av IgM gen 1- 2361 (satt inn på Xba seter) Start ca1200bp fra HindIII Størrelse HindIII Xba1 fragment 3.6Kb BamH1 HindIII Mlu1 Xba1 Xba1 Cµ1 Cµ2 Cµ3 Cµ4 pUC 19 base 1

9. Subkloning • Overføre HindIII-BamH1 fragmentet fra pUC 19 til pLNOH2VNP (Bytte ut CH IgG med CH IgM). • Kutting med restriksjons enzym • Ligering • Transformasjon • Vektor design

10. EcoRI ApoI 351 ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAAT T (Primer 1a PCR soeing) XmaI SacI KpnI SmaI SalI SbfI EcoICRI AvaI HincII PstI BanII Acc65I BamHI XbaI AccI BspMI HindIII 401 CGAGCTCGGT ACCCGGGGATCCTCTAGAGT CGACCTGCAG GCATGCAAGC 451 TTGGCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT...... Utsnitt av pUC19 sekvens BamH1 G’GATCC HindIII A’AGCTT 5’ACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAAT 3’ 3’TGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGAACCGCATTA 5’ SNUDD SEKVENS HindIII:BamH1: 5’ ATTACGCCAGAAGCTT........................................................TCTAGAGGATCCCCGGGGT 3’ 3’ TAATGCGGTCTTCGAA........................................................AGATCTCCTAGGGGCCCCA 5’

11. Xba1 BamH1 5’ ATTACGCCAGAAGCTT........................................................TCTAGAGGATCCCCGGGGT 3’ 3’ TAATGCGGTCTTCGAA........................................................AGATCTCCTAGGGGCCCCA 5’ Restriksjon med Xba 1: 5’ ATTACGCCAGAAGCTT........................................................T CTAGAGGATCCCCGGGGT 3’ 3’ TAATGCGGTCTTCGAA........................................................AGATC TCCTAGGGGCCCCA 5’ Restriksjon med HindIII/BamH1: 5’ ATTACGCCAGA GATCCCCGGGGT 3’ 3’ TAATGCGGTCTTCGA GGGCCCCA 5’ 5’ AGCTT........................................................TCTAGAG 3’ 3’ A........................................................AGATCTCCTAG 5’ HindIII

12. IgM genfragment er satt inn på Xba1 sete: Xba1 T’CTAGA Xba1 Xba1 BamH1 HindIII : 5’ ATTACGCCAGAAGCTT...........TCTAGA.........................TCTAGAGGATCCCCGGGGT 3’ 3’ TAATGCGGTCTTCGAA.......... AGATCT.........................AGATCTCCTAGGGGCCCCA 5’ IgA gebfragment er satt inn på HindIII og BamH1 HindIII BamH1 5’ ATTACGCCAGAAGCTT..........................................................................GGATCCCCGGGGT 3’ 3’ TAATGCGGTCTTCGAA..........................................................................CCTAGGGGCCCCA 5’

14. QuickChange™ Mutagenese Templat pUC19IgM HindIII Mlu1 Xba1 Xba1 Cµ1 Cµ2 Cµ3 Cµ4

15. 1710 1740 1752 GTG GCC CTG CAC ......CTG CCA CCA GCC CGGGAG CAG CTG AAC..... V A L H L P P A R E Q L N 447 457 461 465 Sma1 CCC’GGG Riktige sekvenser: Primer 1: 5’ CTG CCA CCA GCC TCG GAG CAG CTG AAC 3’ Primer 2: 3’ GAC GGT GGT CGG AGC CTC GTC GAC TTG 5’ Primer 2: 5’ GTT CAG CTG CTC CGA GGC TGG TGG CAG 3’ Forandringen ødelegger et Sma1 sete

16. 1a 2b • 1b 2a PCR soeing PCR 1 og 2 Først utføres to vanlige PCR reaksjoner med primer sett 1a og 1b samt 2a og 2b. Smelte temperaturen til de templat spesifikke områdene av alle fire primerene bør være så lik som mulig (varier evt lengden på primerene for å få til dette). Primerene 1b og 2b er designet slik at de har et komplementært område. NB! Legg merke til at det komplementære området kan være en hale (som vist over) som ikke finnes i noen av templatene (insersjons mutagenese), kan finnes fra før i det ene templatet (sammensying av to fragmenter uten innsetting av ekstra baser). Det overlappende området kan også finnes i begge (sammensying). Primerene kan inkluderer base forandringer slik at mutasjoner introduseres.

17. PCR 3: • De komplementære områdene gis anledning til å aneale, og det dannes et dobbeltrådig templat ved syklisk ”primer extention”: • PCR 4: • For å amplifisere templatet fra PCR 3 tilsettes primerene 1a og primer 2a (eller evt 2 andre ytreprimere) og det kjøres en fjerde reaksjon

18. PCR1:  TP og BamH1 sete Lengde 347 base par HindIII Mlu1 BamH1 5’ 3’ C1 C2 C3 Primer 1a Primer 1a anealer fra base 379 i pUC før BamH1 setet (417) i pUC19: 379 417 .......GTA AAA CGA CGG CCA GTG AAT.......... GGATCC 5’GTA AAA CGA CGG CCA GTG AAT3’ NB! BamH1 setet er slutten av genet og IgA kodende sekvens ligger i motsatt retning Primer 1b anealer til den motsatte tråden og er lik IgA sekvens fra starten av IgA Tailpiece) IgA 1582 1638 1891* ....CCC ACC CAT GTC AAT GTG TCT ...............TACTGA (stop codon).....GGATCC P T H V N V S Y 5’ CCC ACC CAT GTC AAC GTT TC 3’ * Innsatt BamH1 sete

19. PCR2 Fra Cµ3 til start Cµ4 TP, med hale lik IgA TP HindIII Mlu1 Xba1 Xba1 Primer 2a Cµ1 Cµ2 Cµ3 Cµ4 Primer 2b Primer 2a er lik kodende sekvens IgM mot slutten av Cµ3 1508 Cµ .......CAG ACC ATC TCC CGG CCC AAG GGT AGG...... 5’ CAG ACC ATC TCC CGG CCC AAG GGT AGG 3’ Primer 2b er komplementær til kodende sekvens Base 2032 IgM gensekvens Mlu1 S T G K P T L Y N V S L 5’.......... start Cµ4................ TCC ACC GGT AAA CCC ACC CTG TAC AAC GTG TCC CTG 3’ 3’.........................................AGG TGG CCA TTT GGG TGG GTA CAG TTA CAC AG 5’ 5’ GA CAC ATT GAC ATG GGT GGG TTT ACC GGT GGA 3’

20. PCR PRODUKT 1 BamH1 1.1) 5’ CCC ACC CAT GTC AAC GTT TC................... ATT CAC TGG CCG TCG TTT TAC 3’ 1.2) 3’ GGG TGG GTA CAG TTG CAA AG................... TAA GTG ACC GGC AGC AAA ATG 5’ PCR PRODUKT 2 Mlu1 2.1) 5’ CAG ACC ATC TCC CGG CCC AAG GGT AGG ................ TCC ACC GGT AAACCC ACC CAT GTC AAT GTG TC 3’ 2.2) 3’ GTC TGG TAG AGG GCC GGG TTC CCA TGG.................. AGG TGG CCA TTTGGG TGG GTA CAG TTA CAC AG 5’ Anealing: 1.1 med 2.1er ikke produktiv 5’ CCC ACC CAT GTC AAC GTT TC.............TCG TTT TAC 3’ 3’ GTC TGG TAG AGG GCC G.......... AGG TGG CCA TTTGGG TGG GTA CAG TTA CAC AG 5’ 11.B med 2A 1B) 3’ GGG TGG GTA CAG TTG CAA AG.......... AGC AAA ATG 5’ 2A) 5’ CAG ACC ATC TCC.................. TCC ACC GGT AAACCC ACC CAT GTC AAT GTG TC 3’

21. PCR2 PCR1 Mlu1 BamH1 2a) 1b) 1a) 2b) ”PCR 3” BamH1 Mlu1 PCR 4