1 / 29

Tecniche cromatografiche

Tecniche cromatografiche. Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico. RIVELATORE. Valvola di ritegno a sfera. Pompa alternativa a pistone. Vantaggi: Robustezza Pressioni in uscita molto elevate (fino a 700 bar) Volume interno ridotto (50 µl) -> adatte all’utilizzo in gradiente

devon
Download Presentation

Tecniche cromatografiche

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Tecniche cromatografiche

  2. Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico RIVELATORE

  3. Valvola di ritegno a sfera Pompa alternativa a pistone Vantaggi: • Robustezza • Pressioni in uscita molto elevate (fino a 700 bar) • Volume interno ridotto (50 µl) -> adatte all’utilizzo in gradiente • Flussi costanti

  4. Valvole di iniezione L’interfaccia universalmente utilizzata per introdurre il campione è la valvola a 6 (o 7) vie. A seconda del loopmontato varia il volume del campione iniettato in colonna

  5. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) • Elevato numero di piatti teorici • Ridotta dimensione delle particelle di matrice • Elevata retropressione della colonna

  6. Colonne per HPLC Pressione fino a 55 MPa (550 Bar)

  7. Rivelatori • Sensibilità adeguata al problema • Buona stabilità e riproducibilità • Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza • Tempi di risposta rapidi • Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti

  8. Rivelatore a indice di rifrazione Il rivelatore a indice di rifrazione misura la differenza nell’indice di rifrazione tra la cella del campione e una cella di riferimento che generalmente contiene soltanto l’eluente. Si utilizza un fascio di luce collimato e filtrato per rimuovere la luce IR che riscalderebbe il campione. Quando l’eluente contenente l’analita entra nella cella del campione, il raggio viene deflesso e inviato al fotodiodo producendo un segnale in uscita differente rispetto a quello prodotto dal solo eluente. Vantaggi e svantaggi È un rivelatore universale, cioè risponde a tutti i composti. Si utilizza per analiti che non assorbono in UV (es. idrocarburi saturi, alcool, eteri) Svantaggi: è poco sensibile, non è compatibile con gradiente di eluizione ed è sensibile a variazioni di p e T.

  9. Rivelatore UV a l fissa La radiazione proveniente da una lampada a vapori di Hg passa attraverso la cella del campione e arriva al fotodiodo. L’intensità della luce assorbita è proporzionale alla concentrazione dell’analita. Vantaggi e svantaggi Il principale vantaggio è il basso costo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254 nm. Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a l fissa.

  10. Il rivelatore UV a l variabile è sicuramente quello maggiormente utilizzato in HPLC. La luce UV proveniente dalla lampada a D2 e scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa è misurata attraverso un fotodiodo ed è proporzionale alla concentrazione dell’analita • Vantaggi • Versatilità: possibilità di selezionare l da 190 a 800 nm. • Elevata sensibilità: potendo scegliere la l ottimale (max assorbanza) per un analita. • Selettività: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la l in modo tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti. • Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una l alla quale la miscela solvente non assorbe.

  11. Rivelatore UV a diode array Il rivelatore UV a l diode array è quello che attualmente viene sempre più utilizzato in HPLC. La luce UV proveniente dalla lampada a D2 passa attraverso una cella a flusso prima che venga scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa ad ogni l è misurata simultaneamente attraverso un array di alcune centinaia di fotodiodi. Un pc può processare, registrare e mostrare gli spettri in continuo durante l’analisi. Inoltre si possono registrare i cromatogrammi a ciascuna l. Vantaggi e svantaggi Presenta gli stessi vantaggi in termini di versatilità, sensibilità e selettività del rivelatore a l variabile. Fornendo anche gli spettri degli analiti, permette di effettuare anche il riconoscimento dei composti analizzati. Svantaggio: è più costoso rispetto al rivelatore a l variabile.

  12. Rivelatore a Fluorescenza La luce UV proveniente da una lampada (filtrata alla opportuna λ) o da un laser, passa attraverso la cella a flusso. Quando un campione fluorescente passa attraverso la cella, assorbe la radiazione, viene eccitato e quindi emetterà la radiazione di fluorescenza ad una maggiore λ. L’intensità della luce emessa viene misurata attraverso un fotomoltiplicatore posto a 90° rispetto al fascio incidente. Vantaggi e svantaggi È un rivelatore molto sensibile, ma risponde soltanto ai pochi analiti fluorescenti. Per aumentarne l’applicabilità si possono legare covalentemente dei marker fluorescenti. Questa derivatizzazione può essere fatta o prima della separazione o post-colonna aggiungendo i reattivi marcanti tra la colonna e il rivelatore.

  13. Cromatografie di ripartizione • Fase diretta (fase staz. polare, eluente apolare) • Fase inversa (fase staz. apolare, eluente polare) Si – O – C18H37

  14. RPC – Eluizione in gradiente acqua – CH3CN

  15. Gel filtrazione • L’interazione avviene tra la proteina e la matrice polimerica. • La matrice polimerica è fatta di microsfere con porosità controllata. • Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione. • Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matrice esce con un volume di eluente pari al Void Volume (volume vuoto).

  16. Gel filtrazione

  17. Gel filtrazione

  18. Gel filtrazione • Vantaggi • Semplice • Prevedibile • Svantaggi • Bassa capacità (piccoli volumi) • Soluzioni non viscose

  19. Gel filtrazione

  20. Determinazione peso molecolare Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL: 40,000 Da (40KDa)

  21. Cromatografie di adsorbimento • Interazione idrofobica • Scambio ionico • Per affinità • Affinità per ligandi (anticorpi) • Proteine ingegnerizzate (His-tag) • Immobilized Metal ion Affinity Chromatography

  22. Coefficiente di partizione - a • Il coefficiente di partizione tra le due fasi, a, è definito come il rapporto tra il soluto adsorbito sulla fase stazionaria rispetto a quello in soluzione nella fase mobile. a = 0 nessun adsorbimento a = 1 tutto adsorbito

  23. Cromatografia di scambio ionico • Scambio anionico • A pH maggiore del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico. • L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o abbassando il pH (più difficile da controllare). • Scambio cationico • A pH minore del pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico. • L’eluizione avviene con [Na+] crescente o alzando il pH.

  24. Scambiatori ionici

  25. Cromatografia di scambio ionico

  26. VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali. Cromatografia di scambio ionico

More Related