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Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1 )

Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1 ). Defensa de Tesis. QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano. Director: Dr. Daniel E. Noyola C herpitel Asesores: Dr. Christian A. García S epúlveda D r. Flavio M artínez M orales.

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Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1 )

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  1. Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1) Defensa de Tesis QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano Director: Dr. Daniel E. Noyola Cherpitel Asesores: Dr. Christian A. García Sepúlveda Dr. Flavio Martínez Morales

  2. Infecciones Respiratorias Agudas • IRAS son causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. • En México • 3° causa de muerte en niños <5años • Tasa de mortalidad 2005 • 18.8 por 100 000 habitantes • En niños menores de 5 años • Tasa de mortalidad 2008 • 28.8 por 100 000 habitantes • Los principales virus que causan IRAS son: Parainfluenza 1-4 hMPV Rinovirus Virus de influenza A y B VSR

  3. 13,588 nt 50-120 nm Genómica de influenza A Complejo Ribonucleoproteico Brown EG. Influenza virus genetics. Biomed & Pharmacother. 2000; 54:196-209

  4. Drift Antigénico Derivación antigénica Shift Antigénico Desplazamiento antigénico Variación genética • Cambios genéticos puntuales que llevan a modificaciones antigénicas menores. • Epidemias • Cambios genéticos por rearreglo que llevan a modificaciones antigénicas mayores. • 10-40 años • Rearreglo entre virus de influenza humana y otras especies • Pandemias

  5. Influenza A (H1N1) pandémica • Marzo-abril 2009 • Neumonías atípicas • Adultos jóvenes • Nueva variante de la influenza A • 11 junio 2009 Nivel 6 • Primera pandemia del Siglo XXI

  6. Justificación

  7. Definir las características epidemiológicas, virológicas y genómicas de cepas de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1) responsables de pandemia en la ciudad de San Luis Potosí. Objetivo general

  8. Realizar un análisis epidemiológico de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1). • Conocer las secuencias del genoma completo de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1). • Realizar un análisis de polimorfismos de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1). • Realizar un análisis filogenético de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1). Objetivos particulares

  9. Materiales y métodos

  10. Diseño de oligonucleótidos • Obtener secuencias “Influenza Virus Resource” NCBI • Alineamiento Clustal W • Robinson´s Alignment Reformatting • Hairpins, homodímeros, heterodímeros y específicidad

  11. Oligonucleótidos de amplificación genómica completa

  12. Oligonucleótidos para secuenciación genómica pb 1 1746 Frg 1 61 pb Frg 2 Frg 3 4(HA) Frg 4 55 pb 115 pb 83 pb 122 pb

  13. Amplificación genómica • PCR anidada • Taq:Pfu • Secuenciación

  14. Secuenciación genómica • Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del CINVESTAV-Irapuato • Electroferogramas • 4peaks

  15. Mutaciones asociadas a la resistencia a fármacos • Zanamivir • D-151 • N, G, E o V • Oseltamivir • H274Y y E119V Neuraminidasa

  16. Análisis bioinformático • Homología • BLAST • dN/dS • “Codon-based Z-test of selection” • “Position-wise based selection estimation (HyPhy)” • MEGA 5 • Recombinación y similaridad • SimPlot versión 3.5.1 • Modelo evolutivo • FindModel • Inferencia del ancestro común más reciente • BEAST v1.5.4, Tracer v1.5 • TreeeAnnotatorv1.5.4, FigTree v1.3.1

  17. Resultados y discusión

  18. Epidemiología • 133 (18.8%) positivas • 17 muestras • 1° marzo 2009- 9 abril 2010 • 706 muestras

  19. Secuencias generadas • 2 genomas completos • 7 parciales • 8(NS) • 8 parciales • Mas de 1 segmento • Superposición para generar secuencia completa • Sin ambigüedad 99% similitud

  20. dN/dS • Hipótesis de neutralidad • dN/dS=0 • Hipótesis de selección purificadora • dN<dS • Hipótesis de selección positiva • dN>dS

  21. Cepas circulantes en una misma temporada son muy parecidas. • El virus tiende a la conservación después de venir de una serie de cambios que provocaron que el virus saltara de hospedero a hospedero. • dN/dS  Selección purificante • Un año de circulación.

  22. Análisis de similitud • Secuencias consenso por hospedero Locales Porcino Humano Aviar

  23. Análisis de similitud • Secuencias consenso por subtipo Locales H1 H2 H5 H9 H4 H3

  24. Análisis de similitud • Secuencias consenso por región geográfica Locales Norte América Asia Europa

  25. Análisis de Bootscan • Secuencias consenso por región geográfica Norte América Europa Asia

  26. Origen geográfico

  27. Fraser C. Pandemic Potencial of a Strain of Influenza A (H1N1): EarlyFindings. Sciencexpress. 11 Mayo 2009.

  28. Eventos de recombinación

  29. Mutaciones puntuales • He et al., 2009 • Recombinación • Diversidad mayor en virus de la influenza aviar.

  30. No existe ningún otro reporte que documente recombinación entre cepas de influenza. • Nosotrosencontramos: • Recombinación de cepas de distintas regiones. • Virus de influenza humana. • Estos datos indican que además de la derivación y desplazamiento antigénico la diversidad genética de influenza también puede generarse por recombinación. • Se desconoce el impacto de este mecanismo en la generación de nuevas variantes de influenza.

  31. Ancestro común más reciente 6(NA) 1(PB2) 4(HA) 7(M2) 8(NS1) 3(PA) 7(M1) 8(NS1) 2(PB1) 5(NP) JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR 2008 2009

  32. Ancestro común más reciente

  33. El MRCA estima la fecha más probable en que el ancestro putativo comenzó a circular. • A medida que más información se compara, la estimación se vuelve más refinada. • Nuestro estudio incluye solamente secuencias mexicanas. • Periodo de estudio: 30 marzo 2009 - 9 abril 2010

  34. Tasas de mutación global

  35. PA Mutación por posición codónica NS1

  36. Tasa de mutación • Es mayor a lo anteriormente reportado. • El virus está evolucionando rápidamente. • Etapas tempranas de la evolución del virus hay una gran diversidad. • Posteriormente predomina la cepa biológicamente más exitosa.

  37. Resistencia a antivirales • No se encontraron las mutaciones • Zanamivir 151 • Oseltamivir  119 y 274 • Presión selectiva • Harvala (2010) • Cepas resistentes a oseltamivir • OMS • 11 agosto 2010 • 120 cepas resistentes a oseltamivir

  38. 0.0 100 200 300 400 Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad 5(NP) 445

  39. 0.0 100 200 300 400 Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad M1 437

  40. Proceso evolutivo • Perpetuarse. • Al principio de la pandemia se originó un número elevado de experimentos biológicos destinados a generar mucha diversidad con la posibilidad de que alguna de las cepas lograra colonizar a un hospedero y convertirse en una cepa biológicamente exitosa.

  41. Conclusión • MRCA es más reciente. • La tasa de mutación global es mayor. • No se encontraron mutaciones que confieren resistencia a antivirales. • La recombinación de segmentos del virus de la influenza entre cepas circulantes en diversas regiones y hospederos es una posible manera en la que se puede explicar la diversidad de estos virus.

  42. Actividades realizadas durante la maestría Febrero 2009 SLP,SLP Curso sobre Infecciones Virales: Epidemiología, diagnóstico molecular y aplicación clínica Junio 2009 SLP,SLP Curso sobre la Tecnología del ADN Recombinante: Producción y purificación de Taq ADN polimerasa Septiembre 2009SLP,SLP Asistente a la I Reunión Académica de Enfermedades infecciosas y su prevención y a la 8ª Reunión Internacional de vacunas Octubre 2009Guadalajara, Jalisco Asistente al XXXIV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica Octubre 2009 SLP, SLP Participación como ponente durante la 16ª Semana de Ciencia y Tecnología

  43. Noviembre 2009 Merida, Yucatán Asistente al VI Congreso Nacional de Virología Mayo 2010 Guadalajara, Jalisco Cartel XXXV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica “Hospitalización asociada a infección por virus de influenza pandémica A(H1N1) 2009 e influenza estacional en pacientes menores de 5 años”. Godoy-Lozano; Contreras-Treviño; Aranda-Romo; Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Hernández-Salinas; Barrios-Compeán; Ochoa-Pérez; García-Sepúlveda; Noyola-Cherpitel. Facultad de Medicina. UASLP. SLP,SLP. Aportaciones a GenBank GU811749, GU811750, GU811751, GU811752,GU811753, GU811754, GU811755, GU811756, GU811757, GU811758.

  44. Manuscritos • Pandemic influenza A(H1N1) 2009 and respiratory syncytial virus associated hospitalizations. Lovato-Salas; Matienzo-Serment;Monjarás-Ávila, Godoy-Lozano, Comas-García; Aguilera-Barragán; Durham-González; Contreras-Vidales; Ochoa-Pérez; Gómez-Gómez; García-Sepúlveda; Noyola . En revisión en Journal of Infection. • Viral DNA ExtractionsfromBloodUsingLaudryDetergent. Guerra-Palomares; Godoy-Lozano; Noyola; García-Sepúlveda. En revisión en NucleidAcidResearch.

  45. Agradecimientos • CONACYT • Asesores • Laboratorio de Virología • Familia • Amigos

  46. Gracias

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