II JORNADA “ACTUALIZACIÓN EN ALIMENTACIÓN Y SALUD” Murcia, octubre de 2004

1. LOS FLAVONOIDES DEL VINO COMO AGENTES PROTECTORES DEL SÍNDROME METABÓLICO Dr. Lluís Arola Ferrer Universidad Rovira i Virgili de Tarragona Departamento de Bioquímica y Biotecnología II JORNADA “ACTUALIZACIÓN EN ALIMENTACIÓN Y SALUD” Murcia, octubre de 2004

2. Riesgo relativo. Mortalidad total Consumiciones por semana EFECTO DEL CONSUMO DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS CONSUMO MODERADO: Hombre: máximo 40 g etanol/día Mujer: máximo 24 g etanol/día

3. INGESTA DE FLAVONOIDES Y MORTALIDAD CORONARIA Gráfico según Hertog et al., Arch Intern. Med., 1995

4. CATEQUINA, un monómero de favanol UVA (pieles y semillas) Raspón Levaduras Barricas de madera Tansresveratrol NO FLAVONOIDES OH OH ÁCIDOS FENÓLICOS: Benzoico, Cinámico O OH OH OH 20-40 mg/l O ESTILBENOS: Resveratrol OH HO PROCIANIDINA B1, dímero OR HO HO O FLAVONOIDES OCH3 HO HO OH OH FLAVONOLES: Quercetina OH OH O O+ Ácido gálico OH OH Tintos ³ 1000 mg/l Blancos < 50 mg /l OH OH Quercetina HO ANTOCIANINAS OCH3 OH O Malvidina-3-glucósido HO OH H FLAVANOLES O-Glucosa O OH MONÓMEROS: Catequina HO OH HO H OLIGÓMEROS: Proantocianidinas OH OH POLÍMEROS: Taninos condensados O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H COMPUESTOS FENÓLICOS

5. 2 0 0 1 8 0 Flavonoles 1 6 0 Proantocianidinas 1 4 0 Catequinas 1 2 0 Antocianinas 1 0 0 Ácidos benzoicos 8 0 Ácidos cinámicos 6 0 4 0 2 0 0 Vino tinto Vino blanco COMPOSICIÓN FENÓLICA DE LOS VINOS (mg/l)

6. POTENTE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE: capturan especies oxigenadas reactivas, quelan metales e inhiben enzimas productoras de radicales libres POTENTE INTERACCIÓN CON PROTEÍNAS C O A B FLAVONOIDE O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H FLAVONOIDES

7. INHIBIDORES DE SISTEMAS GENERADORES DE RADICALES (p. ej., xantina oxidasa) QUELANTES DE IONES METALICOS Fe 2+, Cu 2+ BARRENDEROS DE RADICALES LIBRES Fl(OH) + R· ----- Fl (O·) + RH INTERRUPTORES DE REACCIONES RADICALARIAS EN CADENA (Peroxidación lipídica) AHORRADORESDE VITAMINA E ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS FLAVONOIDES

8. EFECTO TANATO: acción antihemolítica CREACIÓN DE CROSS-LINKS: refuerzo del colágeno OTROS: disminución LDL, aumento HDL, disminución colesterol INTERACCIÓN CON ENZIMAS INHIBICIÓN DE ENZIMAS: histidina descarboxilasa, ascorbato oxidasa, aldosa reductasa, catecol o-metil transferasa, etc BLOQUEO DE SUSTRATOS: reducción de la actividad de colagenasa, elastasa, hialuronidasa, proteasas, etc INTERACCIÓN DE FLAVONOIDES CON PROTEÍNAS

9. INTERACCIÓN CON RECEPTORES CELULARES INTERACCIÓN CON RECEPTORES NUCLEARES MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA INTERACCIÓN DE FLAVONOIDES CON PROTEÍNAS CAMBIOS METABÓLICOS Y FISIOLÓGICOS

10. Los flavonoides condicionan una múltiple capacidad de interacción con proteínas y DNA y condicionan una diversidad significativa de cambios metabólicos. • Los flavonoides inducen una disminución de la mortalidad por patologías cardiovasculares. HIPÓTESIS: ¿Es posible que tengan un efecto directo sobre el síndrome metabólico?

11. SINDROME METABÓLICO: Conjunto de diversos factores de riesgo de patologías metabólicas y cardiovasculares. SINDROME METABÓLICO: Un conjunto de múltiples factores interrelacionados que aumentan el RIESGO CARDIOVASCULAR. Parece que es el resultado de una colisión entre “thrifty genes” suceptibles y una sociedad caracterizada por una aumentada prevalencia de obesidad y un estilo de vida sedentario. El paciente típico se caracteriza por obesidad abdominal, un grado variable de intolerancia a la glucosa, dislipidemia y, a menudo, hipertensión. Los componentes del síndrome metabólico están asociados con resistencia a la insulina, alteraciones en la coagulación y la fibrinolisis, disfunción endotelial y elevación de marcadores de inflamación subclínica.

12. CRITERIOS DIAGNÓSTICOS DEL SÍNDROME METABÓLICO Criterios OMS-98* Criterios NCEP-ATP III Alteración del metabolismo glucidico Resistencia a la insulina y/o Glucemia basal: 110-125 mg/dl Intolerancia a la glucosa Diabetes mellitus HTA y/o TA > 140/90 mmHg IMC > 30 Kg/m2 y/o ICC > 0,90 (♂) o 0,85 (♀) TA > 130/85 mmHg PAbd > 102 (♂) o 88 (♀) cm Exploratorios cHDL < 35 mg/dl (♂) < 39 mg/dl (♀) y/o TG > 150 mgl/dl Microalbuminuria > 20 cg/min (o índice albúmina/creatinina > 20 mg/g) cHDL < 40 mg/dl (♂) < 50 mg/dl (♀) y/o TG > 150 mg/dl Analíticos * EGIR comment on the provisional report of a WHO Consultation. Diabet Med 1999; 16:442-443 **Executive summary of the Third Report of the NECP. ATP III. JAMA 2001; 285:2486-2497

13. Isomaa, B.: Life Sciences, 73, 2395-2411, 2003

14. Reilly, Rader, Circulation 108, 1546-1551, 2003

15. ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: • El peso corporal • El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo • El metabolismo lípidico in vitro • El metabolismo glucídico in vivo • El metabolismo de la glucosa in vitro

16. DISEÑO EXPERIMENTAL • Animales sanos (rata Zucker macho de 250g) • Dieta rica en azúcares y grasa saturada • Consumo voluntario y moderado de vino tinto (1-1,5 ml día) • 8 semanas

17. PESO CORPORAL DE ANIMALES ALIMENTADOS CON DIETA HIPERLIPÍDICA

18. ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: • El peso corporal • El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo • El metabolismo lípidico in vitro • El metabolismo glucídico in vivo • El metabolismo de la glucosa in vitro

19. DISEÑO EXPERIMENTAL • Animales sanos (rata Wistar macho de 250g) • Situación post-prandial • Administración oral (sonda intragástrica) • Dosis elevada de extracto de procianidinas (250 mg EP/kg de peso) • Efecto a corto plazo (5 horas)

20. 250 200 -1 * 150 100 mg dL 50 0 control EP TRIGLICÉRIDOS PLASMÁTICOS

21. DISTRIBUCIÓN DEL COLESTEROL PLASMÁTICO *

22. Lipoprotein lipasa • Músculo • Tejido adiposo EXPRESIÓN GÉNICA HÍGADO • Small Heterodimer Partner (SHP) receptor nuclear, factor clave de la homeostasis lipidica a nivel transcripcional • CYP7A1 colesterol 7 alfa hidroxilasa, enzima limitante en la conversión de colesterol en ácidos biliares • Apo AII • Apo C I • Apo CIII

23. ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: • El peso corporal • El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo • El metabolismo lípidico in vitro • El metabolismo glucídico in vivo • El metabolismo de la glucosa in vitro

24. Medio 24 horas Células 3T3-L1 Células 150 mM epicatequina 150 mM catequina 150 mM extracto de procianidinas A (PM 1296) 150 mM extracto de procianidinas B (PM 1399) METABOLISMO LIPIDICO EN ADIPOCITOS EN PRESENCIA DE FLAVONOIDES Glicerol Parámetros diversos

25. vs control LAS PROCIANIDINAS INDUCEN UNA ACTIVACIÓN DE LA LIPOLISIS EN ADIPOCITOS EN CULTIVO. Los extractos de procianidinas provocan una aumentada lipólisis a largo plazo, tal como indican los niveles de glicerol producidos.

26. 2.0 2,0 a 1,8 a glycerol release vs control 1,5 1.5 1,3 b b 1.0 1,0 0 5 10 15 20 25 m H89 ( mol/L) Effect of H89 on procyanidin-induced lipolysis. Fully differentiated 3T3-L1 adipocytes were treated with 100 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE) in the presence of different concentrations of H89 for 15 hours. H89 treatment was done 10 minutes before PE addition. Data are expressed as glycerol release vs PE-induced lipolysis. Values represents mean ± SEM. The letters (a, b) indicate statistically significant differences between H89 concentrations. EL EFECTO LIPOLITICO DE LAS PROCIANIDIAS REQUIERE LA PARTICIPACIÓN DE LA PROTEÍN QUINASA A La incubación simultanea con procianidinas y H89, inhibidor especifico de la PKA, reduce la lipólisis de forma dosis dependiente, lo que indica la participación directa de la PKA.

27. Effect of procyanidin and epinephrine on cyclic AMP levels. Differentiated 3T3-L1 adipocytes were exposed for 8 minutes to 150 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE) or 1 µmol/L epinephrine. cAMP levels (pmols/mg protein) are normalized to the control levels (100%). Each value represents mean ± SEM. * p < 0.05 compared to control. EL EFECTO LIPOLITICO DE LAS PROCIANIDIAS VIENE MEDIADO POR EL AMPc Las prociandinas aumentan el AMPc al mismo nivel que la epinefrina.

28. LAS PROCIANIDIAS INTERACTÚAN CON RECEPTORES b-ADRENÉRGICOS: Compiten con la epinefrina No se produce un efecto aditivo entre procianidinas y epinefrina sobre la acción lipolítica Effect of procyanidins on epinephrine-induced lipolysis. 3T3-L1 adipocytes were incubated for 15 hours with 0-1000 nmol/L epinephrine in the absence or presence of 100 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE). Glycerol content of the medium (µmol glycerol /mg protein) is normalized to the control values. Values represent mean ± SEM. * p < 0.05 compared to epinephrine-treated cells.

29. De todas las moléculas descritas hasta el momento con acción lipolítica, la molécula que presenta una cinética de acción más similar a las procianidinas es el factor de necrosis tumoral TNF-a. • La acción lipolítica del TNF-a se bloquea mediante la tiazolidinediona BRL49653, un agonista de elevada afinidad del receptor activador de la proliferación de los peroxisomas PPARg. • Actúan de igual forma las procianidinas?

30. Effect of BRL49653 on procyanidin-induced lipolysis. Fully differentiated 3T3-L1 adipocytes were treated with 100 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE) in the presence of different concentrations of BRL 49653 for 15 hours. Data are expressed as % of PE-induced lipolysis. Values represents mean ± SEM. PPARg MEDIATIZA LOS EFECTOS DE LAS PROCIANIDINAS: El agonista de elevada afinidad para PPARg, la tiazolidinediona BRL 49653, antagoniza el efecto lipolítico de las procianidinas El BRL 49653 anula el efecto lipolítico de las procianidinas, lo que indica que está mediado por el PPARg

31. Procyanidin effects on PPARg2 mRNA levels. 3T3-L1 adipocytes were incubated for 15 hours with 100 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE), 0.1 µmol/L BRL 49653 (BRL), and a combination of the two. After treatment, total RNA was extracted and gene expression was quantified by real-time RT-PCR. PPARg2 gene expression, normalized by GAPDH mRNA levels, is expressed relative to control cells. Values represents mean ± SEM. a, b, c indicate groups significantly different with p<0.05. LAS PROCIANIDINAS DISMINUYEN LOS NIVELES DE mRNA DE PPARg La disminución de mRNA de PPARges está también directamente relacionada con la limitación del proceso de diferenciación de la célula adiposa. También el TNF-a manifiesta este efecto desdifrenciador

32. LAS PROCIANIDINAS NO MODIFICAN LA CONCENTRACIÓN INTRACELULAR DE TRIACILGLICEROLES Control PE B mg TAG/mg prot : 0.5 ± 0.025 0.50 ± 0.036 Oil Red O staining of differentiated cells. Fully differentiated (day 10) 3T3-L1 cells were treated for 15 hours with and without grape seed procyanidins B extract (PE) 100 µmol/L and subsequently stained for lipid accumulation with Oil Red O.

33. Las procianidinas modifican el metabolismo de la célula adiposa: • Activando la lipólisis • Interaccionando con receptores b-adrenérgicos • Con la mediación del PPARg • Modificando la lipogénesis. • Las procianidinas parecen limitar la diferenciación de la célula adiposa.

34. ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: • El peso corporal • El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo • El metabolismo lípidico in vitro • El metabolismo glucídico in vivo • El metabolismo de la glucosa in vitro

35. DISEÑO EXPERIMENTAL • Animales sanos (rata Wistar macho de 250g) • Situación post-prandial • Administración oral (sonda intragástrica) • Dosis elevada de extracto de procianidinas (250 mg EP/kg de peso) • Efecto a corto plazo (5 horas) • Animales diabéticos por tratamiento con estreptozotocina

36. EFECTO HIPOGLUCEMIANTE DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS.

37. ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: • El peso corporal • El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo • El metabolismo lípidico in vitro • El metabolismo glucídico in vivo • El metabolismo de la glucosa in vitro

38. Extracto de procianidinas (EP) MW % monómeros % dímeros % oligómeros % oligómeros (3-4 unidades) (5-13 unidades) EP 1399 21.3 17.4 41.3 20 MITUBOS L6E9 ADIPOCITOS 3T3-L1 EFECTO DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS SOBRE LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA. Estudio con cultivos de células sensibles a insulina

39. Captación de glucosa en miotubos L6E9 Captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 pmol gluc /mg prot.min Incubación mixta con insulina y procianidinas en miotubos L6E9 CAPTACIÓN DE GLUCOSA POR CÉLULAS SENSIBLES A LA INSULINA Los compuestos fenólicos aumentan la captación de glucosa. En miotubos no existe efecto aditivo ni estimulador.

40. Captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 Captación de glucosa en miotubos L6E9 ab ab d Wort Ins 1 uM Ins+Wort Wo 100 nM Ins 100 nM Ins+Wort EP 140 mg/L EP 15 mg/l EP+Wort EP+Wort MODIFICACIÓN DE LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA Estudio con wortmanina, inhibidor específico de la enzima PI3K d b b d La inhibición de la estimulación del transporte de glucosa de forma equivalente a la inducida por wortmanina, sugiere que los compuestos fenólicos utiliza una vía equivalente a la de la insulina o requiere la enzima para hacer su efecto.

41. ACTIVACIÓN GLUT-4 pmol gluc /mg prot.min b TRANSLOCACIÓN GLUT-4 c Control EP InsulinaControl EP Insulina Membrana plasmática Endosomas 0 GLUT-4 50 KDa ACTIVACIÓN Y TRANSLOCACIÓN DE GLUT-4 EN ADIPOCITOS 3T3-L1 La adición de SB 203580 muestra una inhibición del 10% del transporte, sugiriendo que la activación del GLUT-4 está activada por compuestos fenólicos. ab SB: SB203580, inhibidor del transportador sensible a la insulina Los compuestos fenólicos inducen una translocación de GLUT-4 del compartimiento endosomal, 3,4 veces superior al control, pero inferior al inducido por la insulina.

42. CAPTACIÓN DE GLUCOSA POR CÉLULAS SENSIBLES A LA INSULINA • Las procianidinas ejercen un efecto similar a la insulina en la célula muscular y la adiposa, estimulando la captación de glucosa y compartiendo un punto clave de la vía de señalización de la insulina: la activación de la PI3K. • En la célula adiposa, las procianidinas estimulan la captación de glucosa ejerciendo un efecto potenciador del efecto de la insulina . Actúan movilizando la translocación a la membrana plasmática y posterior activación de GLUT-4.

43. CONCLUSIÓN Las procianidinas modifican el metabolismo actuando sobre sistemas de señalización celular y sobre la expresión génica. Inducen una situación metabólica que contrarresta el síndrome metabólico. Este efecto puede explicar su efecto cardioprotector descrito por los estudios epidemiológicos.

44. LOS FLAVONOIDES DEL VINO COMO AGENTES PROTECTORES DEL SÍNDROME METABÓLICO Dr. Lluís Arola Ferrer Universidad Rovira i Virgili de Tarragona Departamento de Bioquímica y Biotecnología II JORNADA “ACTUALIZACIÓN EN ALIMENTACIÓN Y SALUD” Muecia, octubre de 2004