1 / 10

Genómová in situ hybridizácia (GISH)

Genómová in situ hybridizácia (GISH). Úvod – in situ hybridizácia. in situ – v pôvodných bunkových štruktúrach hybridizácia NK – proces vzniku ds molekúl z ssDNA (RNA) - princíp komplementarity

eithne
Download Presentation

Genómová in situ hybridizácia (GISH)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Genómová in situ hybridizácia (GISH)

  2. Úvod – in situ hybridizácia • in situ – v pôvodných bunkových štruktúrach • hybridizácia NK – proces vzniku ds molekúl z ssDNA (RNA) • - princíp komplementarity • - odlišná pevnosť kovalentných väzieb a vodíkových mostíkov (denaturácia – renaturácia) • sonda (próba) – značená ss sekvencia DNA (RNA) • techniky in situ hybridizácie umožňujú špecifickým sekvenciám DNA (RNA) byť detekovanými na chromozómoch, bunkách či tkanivách (cieľová DNA, príp. RNA)

  3. cílová DNA denaturace hybridizace sonda Úvod – princíp in situ hybridizácie

  4. genómová in situ hybridizácia (GISH) • princíp: • dva druhy hybridizovali, označíme DNA jedného druhu červenou farbičkou, druhého žltou farbičkou, oba druhy hybridizujú na sklíčku s chromozómami hybrida • výsledok: časť chromozómov špecificky svieti červeno, časť žlto, alternatívne sa pomer ich genetického materiálu líši

  5. GISH - postup • príprava chromozómových suspenzií a preparátov • izoláciaDNA klasickou chloroformovou metódou zo svalového tkaniva determinovaných rodičovských druhov • značenie sondypriame: nukleotidmi konjugovanými s fluorochrómom (napr. Alexa 488-dUTP, Cy3-dUTP) • značenie sondynepriame: technikou nepriameho značenia pomocou haptenov (napr. biotín-11-dUTP) • proces značenia – nick translácia („posun zlomu“)

  6. 5´ 3´ 3´ 5´ DNA neznačené sondy DNáza OH DNáza vytvoří zlom („nick“) 3´ 5´ 3´ 3´ 5´ značený dNTP DNA-polymeráza zařazuje nový nukleotid DNA-polymeráza 5´ 3´ 3´ 5´ DNA-polymeráza prodlužuje řetězec ve směru 5´- 3´ 5´ 3´ 3´ 5´ Nick-translace

  7. GISH - postup • označená sonda sa zmieša s neznačenou kompetitorovou DNA, ktorá je v nadbytku, a ktorú je nutné pred tým najlepšie ultrazvukom (s použitím sonikátoru) nasekať na menšie fragmenty (100 bp) • prečisťovanie a zrážanie DNA pomocou etanolu • resuspendovanie v hybridizačním mixe • denaturácia sondy a kompetitora • denaturácia sklíčka s chromozómovým preparátom • DNA-DNA in situ hybridizácia prebieha v tme dva až tri dni

  8. GISH - postup • posthybridizačné mytie • priame značenie: chromozómy sa zafarbia príslušnou farbičkou a sú prehliadané za použitia primeranej mikroskopickej techniky • nepriame značenie: je nutné po sérii premývaní spraviť detekciu pomocou anti-haptenu (napr. avidínom/streptavidínom), konjugovaným s fluorochrómom (napr. avidin Cy3/FITC) • mikroskopia

  9. Bi et al. 2007 detekcia parentálnych druhov u rodu Ambystoma metódou GISH Verejné poďakovanie agentúre Fondu rozvoje vysokých škol (FRVŠ) za podporenie projektu 416/2010/G4.

More Related