Metodi di studio

1. Metodi di studio

3. Il primo microscopio otticoUn microscopio sempliceHooke, 1665

4. Un moderno microscopio

5. Microscopi ottici da esercitazione

6. Fotocamera o telecamera Oculari Revolver con obiettivi Stativo Tavolino traslatore Fonte di illuminazione Condensatore Diaframma di campo Vite macrometrica e micrometrica Anatomia di un microscopio

7. Anatomia di un microscopio

8. Anatomia di un microscopio

9. Anatomia di un microscopio

10. Microscopia Ottica

11. Microscopia Ottica OSSERVAZIONI A FRESCO • Prime osservazioni • Il preparato si deteriora velocemente • Poco informative • Descrizioni brevi ed inesatte

12. Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica Il materiale da osservare viene posto sulla goccia ed osservato

13. Preparati in campo chiaro Un batterio Campo chiaro, 1000x Cellule

14. Microscopia Otticaa Contrasto di fase • Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto • Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante • Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nell’obiettivo • Iraggi luminosi che sono stati modificati generano fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri gli oggetti illuminati

15. Permette, tramite sistema di lenti di osservare le cellule a fresco Le varie parti della cellula appaiono come strutture con diverse tonalità di grigio Microscopia Ottica a Contrasto di fase

16. Un batterio 400x Un lievito (S. cerevisiae) 400x Una muffa (G. candidum) 400x

17. Un particolare tipo di condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico Osservazione in campo scuro

18. Osservazione in campo scuro

19. Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati • Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio Coloranti vitali Le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse Coloranti che richiedono fissazione Le cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule

20. Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica • Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3) • Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem • Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi)

21. Fissaggiodel campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare) • Generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide) • Cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine • Si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli" • Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto

22. Disidratazionedel campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo • Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H2O • Eliminazionedell'etanolo e passaggi in xilene • Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

23. Inclusionedel campione in in mezzo appropriato paraffina o resina • Tessuti sono "molli" e fragili • Diversi passaggi in paraffina calda • La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2O • La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione

24. Sezione non colorata Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 mm Montaggiodelle sezioni su vetrini per microscopia

25. Colorazione automatizzata Colorazionedelle sezioni con il metodo più appropriato I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo

26. Colorazioni • Colorazione • Con un colore brillante di certe componenti del tessuto • Contro colorazione • Del resto del tessuto con un colore contrastante

27. Ematossilina/Eosina • Ematossilina • Ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine) • Eosina • Ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol)

28. Perchè questa "slide" è blu … • Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila • È colorata dall'ematossilina • Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili

29. … e questa rossa ? • Se una porzione si colora in rosso /arancio/rosa, viene detta acidofila o eosinofila • È colorata dall'eosina • Sono le proteine del citosol

30. Le aree bianche sono lipidi Altre colorazioni • PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) • Per sostanze ricche in zuccheri (muco) • Tricromica o Hazan-Mallory • Per i tessuti connettivi • Le fibre si colorano in blu • Con E&E sono rosa Adiposo Bianco

31. Mielina Cellule nervose Cellule del sangue • Osmio o Sudan black • Per grasso/lipidi/mielina • I lipidi non incorporano coloranti acquosi • Argento ed oro • Per fibre delicate e processi cellulari • Giemsa • Per le cellule del sangue • Simile ad E&E

32. E le aree "bianche"? • I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E • Sangue, linfa etc. • Si riconoscono come ampi spazi bianchi • Anche i lipidi ed il grasso non si colorano Mesenchima

33. Interpretate il campione !!! • Dovete pensare in3 dimensioni • Sezioni serialisono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

34. Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

35. “Artefatti” • Shrinkage • Lascia dello spazio aggiuntivo • Disidratazione e fissaggio • Fratture al piano di taglio • Tagli netti e ben visibili • Lama deteriorata

36. Colorante precipitato • Macchie di colore a "grano di pepe” • Tessuto "pinzato" • Strumento per l'excisione deteriorato • Durante o dopo il sezionamento • Pieghe • Durante il montaggio

38. Microscopia Elettronica

40. Microscopia Elettronica a Trasmissione • Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta • Alta risoluzione • Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi • Gli elettroni passano attraverso il campione

41. La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del MO: 200 nm = 2,000 Angstroms Risoluzione del TEM: 2 Angstroms 1 mm = 1000 µm 1 µm = 1000 nm 1 nm = 10 Angstroms Pinocitosi

42. Preparazione di Campioni Biologici per TEM • Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3) • Fissaggiodel campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio • L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri) • Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari

43. Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina Taglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro) La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm)

44. Montaggiodelle sezioni su di una griglia Colorazione delle sezionicon nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo Visualizzazioneal TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

48. Freeze-fracture • Il tessuto prelevato viene congelato a -140/150 °C • Con un martelletto viene provocata la frattura, secondo le linee di forza del tessuto • Evaporazione e deposizione di metalli pesanti • Eliminazione materia organica

50. Autoradiografia Utilizzando isotopi radioattivi si possono marcare strutture cellulari ben definite e visualizzarle poi tramite microscopia ottica od elettronica