Tadeusz P. Sebzda

1. Tadeusz P. Sebzda Preparaty cystatynowe w terapii nowotworowej Katedra i Zakład Patofizjologii AM, Wrocław 2006 III Seminarium sieci Biotech Dolnośląskiego Centrum Zaawansowanych Technologii

2. Peptydazy cysteinowe • Są to enzymy proteolityczne hydrolizujące wiązania z udziałem reaktywnej reszty cysteinowej w centrum katalitycznym. • Wśród peptydaz cysteinowych ssaków najlepiej poznano lizosomalne katepsyny B, H i L. • W warunkach fizjologicznych peptydazy cysteinowe znajdują się w lizosomach i biorą udział w obrocie metabolicznym białek endo- i egzogennych, resorbcji kości, przekształceniu antygenów oraz w apoptozie.

3. Rodzina CYSTATYN • Rodzina I, zwana stefinami A, B występują głównie w cytosolu komórek. • Rodzina II, nazywana cystatynami, wystepują w płynach ustrojowych, należą do nich cyststyna C oraz slinowe cystatyny S, SA i SN. • Rodzina III obejmuje kininogeny, które są jednołańcuchowymi glikoproteinami, występującymi w surowicy krwi. • Rodzina IV obejmuje tzw. białka nieinhibitorowe.

4. Rola CYSTATYN w NOWOTWORACH Rola cystatyn w procesie nowotworowym sprowadza się do hamowania: • peptydaz cysteinowych uczestniczących w proteolitycznej kaskadzie prowadzącej do przerwania ciągłości błony podstawnej (katepsyny B, L) • peptydaz cysteinowych uczestniczących w angiogenezie nowotworowej (katepsyna B) • proteaz uczestniczących w apoptozie (katepsyna B) • proteaz uczestniczących w aktywacji czynników wzrostu (katepsyna L), lub hormonów peptydowych (katepsyna B, H, L)

5. Planowany eksperyment Wyniki Piśmiennictwo Surowica krwi lub ślina pts wzrost aktywności całkowitej Siewiński i wsp. z nowotworami złośliwymi i spadek wolnych inhibitorów 1992, 1993 r. głowy i szyji Mocz chorych z nowotworami wzrost aktywności całkowitej Siewiński i wsp. okrężniczo-odbytniczymi w porównaniu do chorych 1994 r. z chorobą wrzodową i zdrowymi Homogenaty tkanki raka wzrost stosunku CB/CPI Haczyńska i wsp. jajnika we frakcji błonowej raka 1997 r. jajnika w porównaniu do zdrowego Surowica krwi chorych z wzrost aktywności całkowitej Warwas i wsp. chorych z nowotworami w stosunku do zdrowych i 1997 r. złośliwymi jajnika z torbielami i mięśniakami jajnika

6. Planowany eksperyment Wyniki Piśmiennictwo Hodowla komórkowa rekombinowana cystatyna CCorticchiato O. linie in vitro neutralizuje komórki rakowe i wsp. 1992 r. raka jelita grubego Nowotworowy płyn obecność cystatyn wszystkich Lah i wsp. wysiękowy rak jajnika typów 1991, Matsuoka i okrężnicy i wsp. 1992 r. Nowotwory wątroby wzrost stężenia stefiny A w Tumminello i wsp. surowicy krwi z nowotw. 1997 r. i marskością wątroby w stosunku do zdrowych Rak jelita grubegocystatyna C mRNA koreluje Hirai K. i wsp. u ludzi odwrotnie ze stężeniem 1999 r. katepsyna B Surowica krwi u chorych cystatyna C, stefina A, B: Kos J. i wsp. z rakami jelita grubego wysokie stężenie cystatyn 2000 r. gorsze rokowanie i przeżycie

7. Planowany eksperyment Wyniki PiśmiennictwoRak jelita grubego wzrost ekspresji cystatin- Utsunomiya T. i wsp.na modelu myszy likemetastasis-associated2002 r.i u ludzi protein Nowotwory jajnika stężenie cystatyny C było Nishikawa H. i wsp. znamiennie wyższe niż2004 r.z łagodnymi jajników Nowotwory SCCHN niskie stężenie cystatyny Strojan P. i wsp.szyji i głowy C koreluje z naciekami 2004 r.Hodowla melanoma nadekspresja cystatyny C Ervin H. JL CoxIn vitro hamuje dramatycznie 2005r. inwazję nowotworową indukowaną apoptozą

8. W pracach własnych Zespół podejmuje badania, które zebrać można w trzech grupach problemowych. 1.Badania na materiale ludzkim z surowicy krwi i tkankach nowotworowych od pacjentów z nowotworami jelita grubego oraz sutka 2.Badania eksperymentalne na szczurach z przeszczepialnymi nowotworami typu: hepatoma Morris 1235, rak sutka 3.Badania eksperymentalne w hodowlach komórkowych linii hepatoma Morris 1235 oraz melanoma A375

9. Prace Zespołu, które ukazały się w latach 2000-2006 1:Sebzda T, Saleh Y, Gburek J, Warwas M, Andrzejak R, Siewinski M, Rudnicki J.Total and lipid-bound plasma sialic acid as diagnostic markers in colorectal cancer patients: correlation with cathepsin B expression in progression to Dukes stage.J Exp Ther Oncol. 2006;5(3):223-9. 2:Sebzda T, Saleh Y, Gburek J, Andrzejak R, Gnus J, Siewinski M, Grzebieniak Z.Cathepsin D expression in human colorectal cancer: relationship with tumour type and tissue differentiation grade.J Exp Ther Oncol. 2005;5(2):145-50. 3:Saleh Y, Sebzda T, Warwas M, Kopec W, Ziolkowska J, Siewinski M.Expression of cystatin C in clinical human colorectal cancer tissues.J Exp Ther Oncol. 2005;5(1):49-53. 4:Sebzda T, Saleh Y, Malicka-Blaszkiewicz M, Nowak D, Siewinski M, Ziolkowski P, Kopec W.Actin content and actin polymerization in hepatoma Morris 5123 tumor bearing rats after treatment with cysteine protease inhibitor and vitamin E.J Exp Ther Oncol. 2005;5(1):23-9. 5:Siewinski M, Saleh Y, Gryboc M, Murawski M, Ekonjo GB, Ziolkowski P, Janocha A, Symonowicz K.Determination of cysteine peptidases-like activity and their inhibitors in the serum of patients with ovarian cancer treated by conventional chemotherapy and vitamin E.J Exp Ther Oncol. 2004 Oct;4(3):189-93. 6:Szwed R, Grzebieniak Z, Saleh Y, Ekonjo GB, Siewinski M.Related Articles, Cysteine peptidase and its inhibitor activity levels and vitamin E concentration in normal human serum and colorectal carcinomas.World J Gastroenterol. 2005 Feb 14;11(6):850-3.

10. 7: Sebzda T, Hanczyc P, Saleh Y, Akinpelumi BF, Siewinski M, Rudnicki J.Effect of vitamin E and human placenta cysteine peptidase inhibitor on expression of cathepsins B and L in implanted hepatoma Morris 5123 tumor model in Wistar rats.World J Gastroenterol. 2005 Jan 28;11(4):587-92. 8:Ziolkowski P, Osiecka BJ, Oremek G, Siewinski M, Symonowicz K, Saleh Y, Bronowicz A.Enhancement of photodynamic therapy by use of aminolevulinic acid/glycolic acid drug mixture.J Exp Ther Oncol. 2004 Jul;4(2):121-9. 9:Siewinski M, Saleh Y, Ziolkowski P.Cysteine peptidases in health and diseases.Folia Med Cracov. 2003;44(1-2):169-78. Review. 10:Kielan W, Suzanowicz J, SiewiNski M, Saleh Y, Janocha A, Skalski A, Tarnawa R.Evaluation of changes in the activity of proteolytic enzymes and their inhibitors in the processes that accompany the growth of gastric cancer.Gastric Cancer. 2004;7(1):17-23. 11:Saleh Y, Siewinski M, Kielan W, Ziolkowski P, Grybos M, Rybka J.Regulation of cathepsin B and L expression in vitro in gastric cancer tissues by egg cystatin.J Exp Ther Oncol. 2003 Nov-Dec;3(6):319-24. 12:Saleh Y, Siewinski M, Sebzda T, Jelen M, Ziolkowski P, Gutowicz J, Grybos M, Pawelec M.Inhibition of cathepsin B activity in human breast cancer tissue by cysteine peptidase inhibitor isolated from human placenta: immunohistochemical and biochemical studies.Folia Histochem Cytobiol. 2003;41(3):161-7. 13:Siewinski M, Saleh Y, Popiela A, Ziolkowski P, Jelen M, Grybos M.Expression of high molecular weight cysteine proteinase inhibitor in ovarian cancer tissues: regulation of cathepsin B expression by placental CPI.Biol Chem. 2003 Jul;384(7):1103-7.14:Saleh Y, Siewinski M, Sebzda T, Grybos M, Pawelec M, Janocha A.Effects of combined in vivo treatment of transplantable solid mammary carcinoma in wistar rats using vitamin E and cysteine peptidase inhibitors from human placenta.J Exp Ther Oncol. 2003 Mar-Apr;3(2):95-102. 15:Saleh Y, Ziolkowski P, Siewinski M, Milach J, Marszalik P, Rybka J.The combined treatment of transplantable solid mammary carcinoma in Wistar rats by use of photodynamic therapy and cysteine proteinase inhibitor.In Vivo. 2001 Jul-Aug;15(4):351-7.

11. Leki przeciwnowotworowe • Leki przeciwnowotworowe potencjalnie mogą zabijać komórki rakowe zasadniczo dwoma sposobami: • poprzez wpływanie na wewnątrzkomórkowe przemiany związane z podtrzymaniem procesów życiowych • lub przez uruchomienie wewnętrznego fizjologicznego szlaku śmierci komórki tzw. apoptozy.

12. I. W badaniach na ludzkiej tkance nowotworowej raków jelita grubego: • w badaniach immunohistochemicznych ekspresji cystatyny C i aktywności antypapainowej cystatyn (CPI) (średnia ±SD) wykazano wyraźną zmienność aktywności antypapainowej, narastającej od średnio do słabo zróżnicowanych komórek nowotworowych z wykorzystaniem antykurzych przeciwciał cystatynowych Przedstawia to tabela

13. Table 2. Immunohistochemical expression of cystatin C, and antipapain activity of CPI. Mean ±SD in colorectal cancer, and normal tissues in different stages of carcinogenesis. HistologyImmunohistochemicalP CPI P* grade of cystatinU/mg protein normal tissues (n=30) 0 0.0001 0.04±0.0 0.0001 well differentiated ca (3) +++(3/3) 0.3±0.1 moderately differentiated (10) +++(7/10) 0.6±0.3 poorly differentiated (5) ++(2/5) No 0.9±0.4 adenocarcinoma (7) +++(7/7) 0.5±0.2 invasive adenocarcinoma (13) +++(10/13) 0.8±0.3 grading: 0 no activity, + low activity, ++ intermediate, +++ high P* the significance of the differences in median values of CPI and concentration of cystatin C were calculated by Wilcoxon matched pairs signed-rank test

14. Histology type Tissue differentiation grade (No of patients) Cathepsin B CPI CB/CPI Immunohistochemical staining grade Normal tissue Carcinomas G1 ( 3) G2 (10) G3 ( 5) 18.56.8 22.88.7* 103.295.6* 286.9158.4* 0.20.1 0.30.1* 0.60.3* 0.90.4* 90 76 172 319 0 ++ ( 3/ 3) +++ ( 6/10) + ( 3/ 5) Adenocarcinoma G2 (7) 457.5275.2* 0.50.2* 915 +++ ( 4/ 7) Invasive adenocarcinoma G3 (13) 621.4345.7* 0.80.3* 777 +++ (12/13) Relationship between cathepsin B activity and immunohistochemical expression and CB/CPI ratio in normal and colorectal cancer tissues, in different histology type and celldifferentiation stage CB and CPI were expressed as U/mg protein in homogenate tissues and shown as meanSD. Immunohistochemical grading: 0, no activity; +, low activity; ++, intermediate; +++, high * statistycaly significance in correlation to normal tissue

15. The significance of the differences in median values of tumor and controls tissue were calculated by Wilcoxon matched pairs signed-rank test. Anti-papain activity

16. Immunohistochemiczna lokalizacja cystatyny C w raku jelita grubego u ludzi

17. The survival time and the total cure responses of mammary solid carcinoma in Wistar rats following the combined treatment with vitamin E and CPI. Ten animals were treated in each group.

20. 1. Barwienie jąder komórkowych fluorochromem Hoechst 333422. Analiza mikrofilamentów aktynowych 3. Analiza beta aktyny