Mikroorganismu gēnu inženierija

1. Mikroorganismu gēnu inženierija 7/8. Lekcija 2013./2014. mācību gada 2. semestris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

2. Nukleāzes Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

3. Nukleāzes Nukleāzes ir enzīmi, kas katalizē fosfodiestersaites hidrolīzi starp blakus esošiem nukleotīdiem DNS un RNS molekulās. Nukleāzes var klasificēt pēc to substrāta: - ribo-nukleāzes (RN-āzes) par substrātu izmanto RNS, - dezoksiribonukleāzes (DN-āzes) par substrātu izmanto DNS. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

4. Nukleāzes Nukleāzes var klasificēt: - pēc katalizētās hidrolīzes vietas nukleīnskābes molekulā: - endonukleāzes, pa vidu - eksonukleāzes; no gala Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

5. Nukleāzes EC 3.1.X 3 - hidrolāze 1 - estera saišu X = 11 ekso-dezoksi-ribonukleāzes, kas veido 5`-fosfomonoesterus X = 13 ekso-ribonukleāzes, kas veido 5`-fosfomonoesterus X = 14 ekso-ribonukleāzes, kas veido 3`-fosfomonoesterus Ekso- Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

6. Nukleāzes Endo- EC 3.1.X X = 21 endo-dezoksi-ribonukleāzes, kas veido 5`-fosfomonoesterus X = 22 endo-dezoksi-ribonukleāzes, kas veido 3`-fosfomonoesterus X = 26 endo-ribonukleāzes, kas veido 5`-fosfomonoesterus X = 27 endo-ribonukleāzes, kas veido 3`-fosfomonoesterus Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

7. Nukleāzes Nukleāzes var klasificēt - pēc to katalizētās hidrolīzes specifiskuma; - saitu (vietu, sekvences) specifiskas, - nespecifiskas; - pēc nukleāzes struktūras: - proteīni, - ribozīmi (autokatalītiskas RNS molekulas). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

8. Nukleāzes Viens no gēnu inženierijas pamatinstrumentiem ir saitu (DNS secības) specifiskās proteīnu dabas, endo - dezoksiribonukleāzes (EC 3.1.21...) Tās sauc arī par restriktāzēm, restrikcijas enzīmiem. Ar šo enzīmu palīdzību stingri noteiktā vietā var hidrolizēt divpavediena DNS molekulu un iegūt noteiktus DNS fragmentus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

9. Restriktāzes Restrikcijas endonukleāzes galvenokārt sastopamas baktērijās un kopā ar atbilstošām DNS metiltransferāzēm veido baktēriju restrikcijas - modifikācijas sistēmas. Restriktāzes katalizē divpavedienu DNS molekulas hidrolīzi, atstājot DNS molekulas 5’ galā fosfātgrupu un 3’ galā hidroksilgrupu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

10. Restriktāzes Restrikcijas - modifikācijas sistēmas darbības efekts tika pamanīts jau 1952-1953. gadā. Parādība tika nosaukta par saimniekšūnas inducētu kontroli vai variāciju attiecībā pret baktēriju vīrusu infekcijām. “host-induced variation; host-controlled variation” Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

11. Restrikcijas modifikācijas sistēma Tika salīdzinātas bakteriofāgu infekcijas efektivitātes starp dažādām E. colilīnijām. Noskaidrojās, ka vieni un tie paši bakteriofāgi dažādas E. colilīnijas inficē ar atšķirīgu efektivitāti. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

12. E.coli K 1/1 E.coli B Restrikcijas modifikācijas sistēma Bakteriofāgu infekcijas efektivitāte. 1/1 = 1 vīruss => 1 inficēta baktērija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

13. 1/10 000 E.coli K 1/1 E.coli B Restrikcijas modifikācijas sistēma Bakteriofāgu infekcijas efektivitāte. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

14. 1/10 000 E.coli K 1/1 1/1 E.coli B Restrikcijas modifikācijas sistēma Bakteriofāgu infekcijas efektivitāte. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

15. 1/10 000 E.coli K 1/1 1/1 E.coli B 1/10 000 Restrikcijas modifikācijas sistēma Bakteriofāgu infekcijas efektivitāte. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

16. 1/10 000 E.coli K 1/1 E.coli B Restrikcijas modifikācijas sistēma Bakteriofāgu infekcijas efektivitāte. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

17. E.coli B Restriktāzes 60-to gadu sākumā Werner Arber postulēja, ka saimniekšūnās darbojas mehanismi, kuri bakteriofāgus modificē un nemodificētais DNS materiāls tiek noārdīts. izdalīja pirmo restrikcijas enzīmu – EcoBI Restrikcija = ierobežošana Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

18. modificēts atbilstoši B līnijai Nukleāze EcoBI 1/1 E.coli B nemodificēts vai citādi modificēts Restrikcijas modifikācijas sistēma Bakteriofāgu infekcijas efektivitāte. 1/10 000 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

19. Restrikcijas modifikācijas sistēma 1. Mikroorganismus no svešas DNS sargā restrikcijas endonukleāzes, 2. Paša DNS no endonukleāzēm tiek pasargāta ar specifisku metilēšanas sistēmu, kura metilē attiecīgās endonukleāzes apdraudēto vietu DNS molekulā. 3. Metilēto (modificēto) DNS attiecīgā endonukleāze par substrātu nevar izmantot. 4. Dažādiem mikroorganismus celmiem ir atšķirīgas restrikcijas-modifikācijas (metilēšanas) sistēmas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

20. Restrikcijas modifikācijas sistēma Nozīme dabā: - Pasargā baktērijas no svešas DNS (vīrusu infekcijas); - Ierobežo baktēriju iespējas savstarpēji krustoties (nodrošina labāku sugu un līniju pastāvēšanu); - [+/-] nosaka baktēriju “dzimumu”. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

21. E.coli K Restrikcijas enzīmi 1968. gadā Matt Meselson un Bob Yuan izdalīja restrikcijas enzīmu no Escherichia coli K-12 līnijas, ko nosauca par EcoKI. Vēlāk raksturoja līdzīgu enzīmu E. coli B līnijā. Abi enzīmi atpazīst stingri noteiktas DNS secības: EcoBI TGA(N8)TGCT EcoKI AAC(N6)GTGC, taču DNS hidrolīze tiek katalizēta citā, precīzi nenoteiktā vietā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

22. Restrikcijas enzīmi 1970. gadā Hamilton Smith un Kent Wilcox no Haemophilus influenzaeRd izdalījarestrikcijas enzīmu "endonukleāze R”. Atpazīstamā DNS secība un enzīma katalizētās hidrolīzes vietas bija stingri noteiktas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

23. Restrikcijas enzīmi 1970. gadā Hamilton Smith un Kent Wilcox no Haemophilus influenzaeRd No T7 bakteriofāga DNS pēc apstrādes ar "endonukleāzi R” varēja iegūt noteikta garuma DNS fragmentu kopu. . Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

24. Restrikcijas enzīmi Vēlāk gan izrādījās, ka "endonukleāze R” ir divu enzīmu: Hind II un Hind III maisījums (~1975), bet T7 vīrusa DNS nebija neviena Hind III atpazīšanas saita. Sadarbībā ar Tom Kelly tika noteikta enzīmam atpazīstamā DNS sekvence - GTYvRAC (Y = C vai T; R = G vai A) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

25. Restrikcijas enzīmi 1971. gadā Daniel Nathans pirmais veica vīrusa SV40 genoma un gēnu kartēšanu izmantojot "endonukleāzi R” - parādīja, cik restrikcijas enzīmi noderīgi DNS pētījumos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

26. Restrikcijas enzīmi Ar to arī sākās jauna veida DNS kartēšana - ar restrikcijas enzīmu palīdzību. DNS tiek apstrādāts ar enzīmu A - tiek noteikts iegūto DNS fragmentu skaits un izmērs; DNS tiek apstrādāts ar enzīmu B - tiek noteikts iegūto DNS fragmentu skaits un izmērs; DNS tiek apstrādāts ar enzīmu A + B maisījumu - tiek noteikts iegūto DNS fragmentu skaits un izmērs. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

27. Restrikcijas enzīmi Tādā veidā iespējams noskaidrot restrikcijas enzīmu šķelšanas vietu savstarpējo novietojumu un tās iezīmēt DNS kartēs. Metode veiksmīgi pielietojama salīdzinoši nelielu DNS (palzmīdas, vīrusi) kartēšanā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

28. Restrikcijas enzīmi 1972. gadā Yoshimori izdala unraksturo restrikcijas enzīmus no Escherichia coli R līnijām: EcoRI - GvAATTC (RY13) EcoRII - vCCWGG (R245) (W = A vai T) - atpazīst palindromiskas secības, - pēc DNS apstrādes attiecīgi veido 4 un 1 nukleotīdu pārkares. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

29. Restrikcijas enzīmi 1978. gada Nobela prēmija fizioloģijā un medicīnā. Werner Arber Hamilton Smith Daniel Nathans Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

30. Restrikcijas enzīmi Vairākas laboratorijas uzsāka aizrautīgu jaunu restrikcijas enzīmu meklēšanu. Aprakstīto enzīmu skaits strauji pieauga. Sākotnēji laboratorijas izdalīja atrastos enzīmus pašas, savstarpēji apmainījās ar - izdalītajiem enzīmiem, - tos saturošajām baktēriju līnijām un - izdalīšanas metodiku. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

31. Restrikcijas enzīmi Restriktāžu pielietojums zinātniskos pētījumos ieguva tik plašus apjomus, ka šāda starplaboratoriju apmaiņas prakse kļuva traucējoša. 1975. gadā kompānija “New England Biolabs” uzsāka restrikcijas enzīmu komerciālu izplatīšanu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

32. Restrikcijas enzīmi Drīz šim piemēram sekoja arī citas firmas. Kopš EcoKI un EcoBI atklāšanas 1960-to gadu beigās pašlaik aprakstītas vairāk nekā 3 600 dažādas restriktāzes, to pārstāvji DNS šķeļ vismaz 250 dažādos veidos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

33. Restrikcijas modifikācijas sistēma Restriktāžu nosaukumus veido: - 3 burti kursīvā, kas apzīmē baktēriju sugu, no kuras restriktāze tika izdalīta, - burts, kas apzīmē specifisko baktēriju līniju, - romiešu cipars, kas apzīmē dažādas restrikcijas sistēmas no vienas un tās pašas līnijas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

34. Restriktāzes EcoRI - Escherichiacolicelma RY13 pirmā restrikcijas sistēma, PstI - Providenciastuartiipirmā restrikcijas sistēma. Dabīgā baktēriju restrikcijas sistēmā ietilpst arī metiltransferāzes. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

35. Metiltransferāzes (metilāzes) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

36. Metiltransferāzes Katalizē metilgrupas pārnešanu no kofaktora - S-adenozilmetionīna (SAM) uz DNS. Atpazīst +/- to pašu nukleotīdu secību, ko atbilstošās restrikcijas-modifikācijas sistēmas restriktāze. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

37. Metiltransferāzes Metiltransferāžu aktivitātei nepieciešams koenzīms S-adenozilmetionīns (SAM)Ko-faktors - metil grupu pārnesējs (donors) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

38. Metiltransferāzes kopumā katalizē metilgrupas piesaistīšanos adenīna un citozīna bāzēm 3 dažādās vietās- adenīna 6-NH2;- citozīna 4-NH2;- citozīna 5-C Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

39. Metiltransferāzes To katalizētās DNS modifikācijas: CpG (SssI) metilāze - 5’mCG3’ dam metilāze - 5’GmATC3’ EcoRI metilāze - 5’GAmATTC3’ HaeIII metilāze - 5’GGmCC3’ Nav restrikcijas-modifikācijas sistēmu metiltransferāzes Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

40. Metiltransferāzes Pielietojums: • noteiktu restriktāžu atpazīstamo sekveņču bloķēšana, palielinot restrikcijas specifiskumu, • palielinot šķelšanā iegūto fragmentu garumu, • pētot CpG metilācijas ietekmi uz gēnu ekspresiju • DNS iezīmēšanai ar [3H] • DNS <=> proteīnu mijiedarbības pētījumos Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

41. Restriktāzes Restriktāzes iedala 4 klasēs un vairākās apakšklasēs: I. klase - restrikcijas un modifikācijas aktivitātes piemīt viena enzīma kompleksa dažādām subvienībām. Nukleāzes aktivitātei nepieciešami Mg2+, ATP un SAM, DNS hidrolīzes gaitā ATP noteikti tiek hidrolizēts. EC 3.1.21.3 Pie pirmās klases pieder restrikcijas - modifikācijas enzīmi EcoBI un EcoK. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

42. Restriktāzes I. klase . EcoK atpazīst 15 bp. garu DNS secību (5’-AACNNNNNNGTGC-3’) un katalizē nespecifisku DNS hidrolīzi aptuveni 1000 nt. no pazīšanas vietas. ATP nepieciešams enzīma translokācijai uz šķelšanas vietu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

43. Restriktāzes II. klase - restrikcijas un modifikācijas (metilēšanas) aktivitātes piemīt atškirīgām, nesaistītām enzīmu molekulām, - nelielas proteīnu molekulas. Restriktāzes aktivitātei nepieciešami tikai Mg2+. EC 3.1.21.4 II. klasei pieder lielākā daļa GI izmantojamo restrikcijas enzīmu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

44. Restriktāzes II. klase Restriktāze pazīst noteiktu DNS secību un katalizē DNS hidrolīzi noteiktā vietā. Attiecīgās sistēmas metiltransferāzes pazīst noteiktu DNS secību un katalizē A vai C nukleotīdu metilēšanu abos DNS pavedienos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

45. Restriktāzes II. Klases restriktāzes iedala 6 apakšklasēs atkarībā no DNS pazīšanas specifiskuma, katalizēto hidrolīzes reakciju veida un jūtības pret DNS piesaistītu metilgrupu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

46. Restriktāzes IIW klase - atpazīst 5 vai 7 (nepāra) nukleotīdu palindromus RsrII …..CG v GWCCG….. …..GCCWG vGC….. (W = A vai T) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

47. Restriktāzes IIP. klase - visbiežāk lietotās restriktāzes. Atpazīst 4, 6 vai 8 (pāra) nukleotīdus garas palindromiskas secības un hidrolīzi katalizē šajās vietās. Palindromiskās secības vienlīdz labi var tikt atpazītas no abām pusēm. Aprakstīti vairāki gadījumi, kad plaindromiskās secības saista enzīmu dimēri. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

48. Restriktāzes IIP klase PvuII …..CAG v CTG….. …..GTC vGAC….. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

49. Restriktāzes IIN. klase - restriktāzes atpazīst pārtrauktus palindromus, kas satur rajonu ar nenoteiktu nukleotīdu secību. Restriktāzes hidrolīzi katalizē šajā vietā. BglI …..GCCNNNN v NGGC….. …..CGGN vNNNNCCG….. (N = A, C, G vai T) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

50. Restriktāzes IIS. klase - restriktāzes atpazīst 4 līdz 6 nt. garas asimetriskas secības un DNS hidrolīzi katalizē 1 līdz 20 nt. attālumā no atpazīstamās sekvences, vienā saita pusē. AlwI …..GGATCNNNN v N….. …..CCTAGNNNNN v….. (N = A, C, G vai T) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.