1 / 36

SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍCH NEMOCÍ

SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍCH NEMOCÍ. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA INFEKČNÍCH NEMOCÍ:. PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR. NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ Stanovení protilátek obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.)

ophelia-ambrosia
Download Presentation

SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍCH NEMOCÍ

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍCH NEMOCÍ

  2. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA INFEKČNÍCH NEMOCÍ: PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR

  3. NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ • Stanovení protilátek • obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.) • retrospektivní nález (epidemiologie) • Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM

  4. IgG IgM Množství protilátek IgA čas DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

  5. TECHNIKY SÉROLOGICKÉHO PRŮKAZU INFEKČNÍCH NEMOCÍ: DVOJITÁ IMUNODIFÚZE (OUCHTERLONY) • precipitace v gelu v Petriho miskách • do gelu difunduje proti sobě Ag a Ab • v bodě ekvivalence vzniká precipitační linie • kvalitativní průkaz • příklady použití: • systémové kandidózy (C. albicans, krusei) • aspergilózy (A. flavus, fumigatus, niger, terreus)

  6. AGLUTINACE • korpuskulární antigen • reakce Ag s Ab se projeví jako viditelný aglutinát • důležitá je příprava antigenu: kultivace mikroba, • promytí suspenze, nastavení optim. hustoty, • inaktivace (teplota, fenol ...) • použití: • průkaz protilátek • identifikace mikroba známým antisérem • provedení: • mikrotitrační destičky • zkumavky • kvantitativní stanovení - ředění séra geometrickou řadou • titr = převrácená hodnota nejvyššího ředění séra, • které ještě dává pozitivní reakci (ředění 1:160 = titr 160) • sledování dynamiky titrů !

  7. ŘEDĚNÍ SÉRA

  8. PŘÍKLAD AGLUTINAČNÍ TECHNIKY V DESTIČCE

  9. AGLUTINACE • příklady použití aglutinace: • Listerióza (L. monocytogenes) • (sérotyp O-I, II nebo O-V) • hodnocení: titr>160, dynamika (párové vzorky) • Tularémie (Francisella tularensis) • hodnocení titr>20, dynamika (párové vzorky) • Pertuse, parapertuse (Bordetella pertussis, parapertussis) • hodnocení: očkování ! • (směrodatný je min. 4-násobný vzestup nebo pokles titrů)

  10. AGLUTINACE • Brucelóza (Brucella abortus) • inkompletní (blokující) protilátky - váží se na Ag ale neaglutinují ho • Coombsův test (s antiglobulinovým sérem) • chronické stadium infekce

  11. AGLUTINACE • Salmonelózy(Salmonella sp.) - Widalova reakce • sérotypy • antigeny O – somatické • antigeny H – bičíkové • Vzhled aglutinátu • kompaktní, zrnitý - Ab proti O (somatickým) Ag • chomáčkovitý (roztřepatelný) – Ab proti H (bičíkovým) Ag • antigen Vi (povrchový, polysacharidový • – stnovuje se jinou metodou - hemaglutinací) • Kaufmannovo-Whiteovo diagnostické schéma • provedení ve zkumavkách • hodnocení: titr>80, dynamika

  12. AGLUTINACE

  13. NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE • bakteriální Ag je navázán • na zvířecích erytrocytech (nosič) • polysacharidové Ag se váží přímo • proteinové Ag se váží po opracování (tanin, CrCl3) • kvantitativní test (titr) • příklady použití: • Yersinia enterocolitica(O3), • Yersinia pseudotuberculosis • syfilis (Treponema pallidum, TPHA) • Salmonella typhi (Vi Ag)

  14. NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE

  15. PŘÍKLAD VÝSLEDKU HEMAGLUTINAČNÍ TECHNIKY

  16. TEST INHIBICE HEMOLÝZY (NEUTRALIZAČNÍ TEST) • ASO (antistreptolysin O, ASLO) • infekce Streptococcus pyogenes • ( hemolytický streptokok skupiny A) • sterilní následky streptokokových nákaz • (revmatická horečka, glomerulonefritida) • provedení: • SLO (streptolysin O) hemolyzuje erytrocyty in vitro, • v přítomnosti protilátek dochází k zábraně hemolýzy • - test inhibice hemolýzy (neutralizační test) • kvantitativní test (Uml) • hodnocení: >200, dynamika(párové vzorky) • alternativa – stanovení ASO nefelometricky

  17. STREPTOLYZIN (ASLO) - inhibice hemolýzy

  18. NEPŘÍMÁIMUNOFLUORESCENCE • protilátková odpověď v jednotlivých třídách Ig • (IgM, IgG) • kvalitativní provedení (základní ředění séra) • kvantitativní provedení (titry) • příklady použití: • borelie • syfilis - FTA-ABS

  19. NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE

  20. ENZYMOVÁ IMUNOSORPČNÍ ANALÝZA (ELISA) • Lze využít jak pro stanovení protilátek (v izotypech IgG, IgM aj.) • tak pro stanovení antigenu • komplex Ag - Ab detekován sekundární protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza) • komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab) • se odstraní promytím • Ag:celobuněčný lyzát (rozbití ultrazvukem, hypotonické prostředí, • zmražování - rozmražování), bakteriální exoprodukty, • rekombinantní Ag aj. • protilátková odpověď v jednotlivých třídách Ig(IgG, IgM) • vysoká citlivost (1ng/l) • hodnocení testu • kvalitativní (hraniční sérum, cut-off) • kvantitativní (kalibrační křivka)

  21. ENZYMOVÁ IMUNOSORPČNÍ ANALÝZA (ELISA) • příklady použití ELISA technik • protilátky proti Helicobacter pylori • protilátky proti borelióze • (B. burgdorferi, garinii, afzelii) • protilátky proti virovým infekcím • (herpetické viry, hepatitidy, • HIV a mnoho jiných) • přímý průkaz Ag (HBsAg, HIV)

  22. ELISA – průkaz specifických protilátek

  23. ELISA – průkaz antigenu

  24. IgM „capture“ – průkaz specifických protilátek IgM proti infekčnímu agens (odstranění vlivu specifických IgG protilátek)

  25. TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA

  26. WESTERN BLOT (IMUNOBLOT) • průkaz přítomnosti protilátek proti jednotlivým Ag (bakteriálním, autoantigenům, ...) • krok - elektroforéza • proteiny ve směsi se rozdělí podle mol. hmotnosti na polyakrylamidovám gelu v přítomnosti SDS (dodecylsíran sodný – anionický detergent) • - udělí proteinům záporný náboj • 2. krok - blotování • transport proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu v elektrickém poli

  27. WESTERN BLOT (IMUNOBLOT) • 3. krok - imunodetekce • přidání vzorku • (sérum pacienta s IgG proti antigenům B. burgdorferi) • přidání sekundární protilátky • (zvířecí antisérum proti lidskému IgG značené Px) • přidání substrátu • (v místě vazby specifické protilátky na Ag • vzniká barevná reakce) • 4. krok - vizuální hodnocení přítomnosti (intenzity) • barevné reakce u specifických • bakteriálníchAg

  28. WESTERN BLOT (IMUNOBLOT) • příklady použití: • borelióza (B. burgdorferi) • – konfirmace výsledků testu ELISA • Helicobacter pylori – sérologický průkaz infekce kmeny s vyššímpatogenním potenciálem • (CagA antigen) • AIDS (HIV) konfirmace ELISA technik

  29. IMUNOBLOTOVÁ ANALÝZA PROTILÁTEK PROTI BORRELIA BURGDORFERI POZITIVNÍ KONTROLA KLINICKÉ VZORKY IgM IgG

  30. SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS • 1. vyhledávací (screeningové) testy • krevní dárci, dárci orgánů, těhotné, • podezření na syfilis • 1.1. Rychlá reaginová reakce (RRR, RPR, VDRL) • netreponemový test • reaginy (Ab proti Ag lipidového charakteru - kardiolipin) • nepřímá aglutinace – nosič Ag uhlíkové částice • provedení na sklíčku, papírové kartičce, v destičce • hodnocení kvalitativní, titry • reakce 2-3 týdny od počátku infekce, • titry reagují na léčbu

  31. SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS • 1.2. TPHA • treponemový test • nepřímá hemaglutinace s antigenem • T. pallidum navázaným na zvířecí erytrocyty • kvalitativní test (základní ředění 1:80) • zůstává pozitivní celý život

  32. SÉROLOGICKÝ PRůKAZ SYFILIS • 2. Konfirmační testy • 2.1.FTA-ABS • nepřímá imunofluorescence • Ag T. pallidum – Nicholsův kmen • nutno předem vysytit séra sorbentem(ABS) • sorbent –vysytí protilátky proti nepatogenním treponemám • (T. macrodentium, refringens,denticola, orale) • hodnocení: titry • IgG x IgM (časná infekce, vrozená syfilis)

  33. SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS (FTA-ABS)

  34. SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS • 2.2. ELISA test • specifický antigen navázaný na destičku • IgG x IgM odpověď • 2.3. TPI (imobilizační test) • provádí referenční laboratoř Praha • suspenze živých treponem + sérum (Ab) • + komplement • pozitivní výsledek = imobilizace 50% treponem • především diagnostika pozdní (neléčené)syfilis

More Related