Agilent Technologies DNA Fish ID Solution

1. Agilent Technologies DNA Fish ID Solution

2. Identificación de pescados–Impacto en el mercado • Métodos basados en Proteinas o DNA • Uso para análisis de fraudes potenciales, mal etiquetado o casos de substitución eSpecies Legislación Sostenibilidad Industria Dirección de Cadena de suministro Consumidores Valor del producto, satisfacción del cliente

3. Métodos de identificación de pescados - Tradicional Regulatory Fish Encyclopedia: U.S. Food and Drug Administration, 1993-2009

4. Métodos de identificación de pescados – DNA Secuenciación • Alta inversión incial (> 100K $) • Alto coste de mantenimiento • No aplicable con muestras mezcladas • Métodos de elección para nuevas especies. PCR-RFLP • Discriminación entre especies sumamente relacionadas • Trabaja con mezclas • Bajo coste inicial

5. Método de identificación de pescados– PCR RFLP • Mitocondrias: Alto número de copias • Comunmenteempleado el gen Cytochrome B (CytB) o CytochromeOxidase I (COX1) • La secuencia del CytBaportainformaciónparaespecies de pescados. Food Control 16 (7), 601-607, (2004) Amplificar la región de interés en ADN Fragmentar el ADN para generar los modelos especificos Extraer el ADN PCR RFLP J Agric Food Chem 53 (9), 3388-3357 (2005) http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-2982EN.pdf • La PCR RFLP es un metódoacreditado/aprobado en muchospaíses. • Transferencia del método a 2100 Bioanalyzer para mejorar el análisis edición 2004 y 2005 por Stephen Garrett de Campden BRI (Reino Unido)

6. Agilent DNA Fish ID Solution • El Agilent DNA Fish ID solution es un método simple, rápido y precisobasado en el screening del ADN para la identificación de diferentesespecies de pescados frescos y procesados . • Mejorar la calidad de los productos • Reducir el impactomedioambiental de actividadesilegales en la industriapesquera. • Mantener los registros adecuados para el cumplimiento con las regulaciones gubernamentales. 

7. 2100 Bioanalyzer VS Capillary Electrophoresis system gelelectrophoresis tradicional 2100 Bioanalyzer Lab-on-a-chip system Preparar y correr el gel (1 - 3 h): Grandesvolumenes de muestranecesarios  • Preparación de los chips(5 - 15 min): • Procedimiento simple paraseguir el protocolo • Bajovolumen de muestra (1 µl) Ticción, desteñido y adquisición de imagenes (0.5 – 1 h): Baja sensiblidad (>50 ng DNA)  Las imagenesnecesitan ser digitaizadas • Run y Detección (30 min): • Alta sensiblidad (0.1 ng of DNA) • Datos en formato digital Analisis: Resoluciónrestringida  Alta variabilidad de tamaño  No precisióncuantitativa  información • Analisis: • Analisis automatizado (tamaño y cuantificación) • Comparación entre muestras y runs • Alta resolución(5 bpdiferencia) + precisión (± 10%) Gel analisis > 2 h < 1 h

8. Agilent DNA Fish ID Solution - Generación de modelos de especies específicos Amplificación de secuencias de identificación de especies Purificación de la muestra < 1 h(dependiendo # muestras) ~ 1.5 h ~2.5 h Análisis de modelos usando el RFLP Decoder ~ 6 h de muestra al resultado < 1 h (dependiendo de # muestras)

9. Paso 1: Extracción de ADN de tejidos en pecesusando el Agilent DNA Fish ID Solution • 1. Utilizar 40 mg – 1 g tejido (fresco, congelado, o procesado)Homogenización opcional • 2. Digerir con Proteinasa K Digestion BufferIncubar a 65oC for 10 min Total Time: 15 min • 3. Obtener el ADN de la spin column • 5 min • 4. Lavar con High Salt Buffer (1X) • Lavar con 80% Etanol (3X) • 5 min • 5. Eluir ADN • 5 min < 1 hr del tejido al DNA Public September 12, 2014

10. Alto rendimiento de la variedad A de muestras de pescado Agilent Kit Competitor Kits Extracciones de variedades de especies de pescado Total yield, µg Total yield, µg Average 260/280: 1.41 Average 260/280: 2.09 Rango de rendimiento: 2-18 µg en 40 mg tejido Pureza: Media de 2.19 A260/A280 PCR Requerimientos: 0.5 – 500 ng Rendimiento en diferentes muestras alternativas (40 mg por muestra) 43µg DNA Yield, ug 6.6µg 3.7µg Public September 12, 2014

11. Step 2: PCR PCR Master Mix PCR Cycling1.5-2 hrs Fish Primer Mix cytb PCR Amplicon + 1 µl Extracto ADN de pescado O Control positivo ADN de Salmon Public September 12, 2014

12. Validación de la amplifiación de diferentesespecies de pescado Atlantic salmon Pacific Cod Tilapia (farm) Tilapia (wild) Dover Swai Catfish Trout Salmon (farm) scallop Snapper Tuna Public September 12, 2014

13. Polymerase Chain Reaction (PCR) – Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) PCR: Amplificar con primers genéricos para peces PCR productos: “amplicon” Digerir conEnzyme A Digerir con Enzyme C Digerir con Enzyme B Muestra ADN SPECIES 1 SPECIES 2 ELECTROFORESIS Public September 12, 2014

14. Step 3: Digestión con Enzimas de restricción PCR Amplicon Digerir con Nla III Digerir con Hae III Digerir con DdeI (2 hr tiempo de digestión) Inactivar Enzimas con EDTA @ 65°C x 15 min Public September 12, 2014

15. Step 4: Bioanalyzer Lab-On-A-Chip Electrophoresis Preparar Fish ID Chip Añadir PCR-RFLPproductos Correr muestra en el Agilent 2100 Bioanalyzer Analizar resultados • Seleccionar aplicación • Click START • <30 min run C B A C B • Cargar muestra ( 1 µL) • Agitar 1 minuto • Descongelar los reactivos • Preparar gel/dye mix A Public September 12, 2014

16. Digestión restrictiva de los amplicons de diferentes muestras de pescados Positive Control Pacific Cod Tilapia (farm) Tilapia (wild) Dover Swai Catfish Trout Snapper Tuna DdeI Hae III Nla III Public September 12, 2014

17. Interpretación de Resultados – RFLP Decoder Software Pattern 1(Dde I)scoring panel Pattern 3(Nla III)scoring panel Pattern 2(Hae III)scoring panel Sample selection Puntuación combinada: Indica la mayoría de las especies El valor de la Puntuación indica la calidad del emparejamiento. Histograma: La Separación de las principales especies de aquellas con menor puntuación ofrece una mayor confianza en el resultado. Public

18. Paso 5: Coincidencia de modelos con el RFLP Decoder Software Entrada manual o Automatica de los productos digeridos Rangos de puntuación para cada enzima en relación a las especies Puntuación combinada de las 3 digestiones en relación a una especie. Public September 12, 2014

19. Coincidencia de patrones: RFLP Report Public September 12, 2014

20. Modelos de RFLP con mezclas de pescados Cod Haddock Mixture Limites de detección en mezclas: 5% Public September 12, 2014

21. Resumen de Agilent DNA Fish ID Solution • Fácil de usar y simple • Los Reactivos + Equipo+ software = Solución completa Patrones de base de datos de especies específicas elimina la necesidad de autentificado de muestra en la misma prueba • Resultadosrápidos de un ampliorango de muestras • De la muestra al resultado en un soliodía de trabajousando un protocolo simple • Aplicable a pescadoscrudos, cocidos, ahumados, secos y salados • Resultadosprecisos y fiables • Basados en un metodofiableaprovado y acreditado en muchospaises. • Base de datosampliablepor el usuario y teóricosperfiles de más de 200 especies.

22. Agilent DNA Fish ID Solution: Referencias: • Agilent DNA Fish ID Ensemble - 5500-0100 • Agilent DNA Isolation Kit - 5500-0051 • Agilent PCR-RFLP Fish ID Kit - 5500-0001 • Agilent DNA 1000 Kit - 5067-1504 • Agilent RFLP Decoder Software, Fish - G5301A • Agilent 2100 Bioanalyzer with chip priming station and IKA vortex mixer – G2939AA

23. Muchas gracias! HUGO_MINGO@AGILENT.COM AMPARO_DAVILA@AGILENT.COM