Gljive i biotehnologija

1. Gljive i biotehnologija Predmet: Biotehnologija Mr Maja Karaman PMF, Novi Sad

2. GLJIVE (FUNGI, MYCOTA) • Eukariotski mikroorganizmi koje čine posebno carstvo živor sveta na osnovu ishrane bazirane na apsorpciji nutrijenata • prema biohemisjkim karakteristikama pokazuju veliku sličnost sa životinjama ali i neke sličnosti sa biljkama • Heterotrofi (saprofiti ili paraziti); ne poseduju fotosintetske pigmente • poseduju ćelijski zid od hitina, • Sadrže melanin • rezervna materija je glikogen, • poseduju ćel. membranu, citoplazmu, jedro • Razmnožavanje – polno i bespolno • Jednoćelijske gljive- kvasci (pupljenje, pseudomicelije) • Višećelijske gljive mikroskopskih veličina- filamentozne plesni (hife- septirane i neseptirane/ micelija) Saccharomyces sp.

3. Značaj:negativan: • Uzročnici mnogih bolesti (ekonomske štete u šumama- fitopatogene gljive; kandidijaza kod ljudi) • Producenti toksina (mikotoksini)- kvarenje namirnica • Biodegradacija različitih materija (“micro fungi”) Pozitivan: • Primena u biotehnologiji (proizvodnja alkoholnih pića, peciva, sireva, antibiotika, enzima, itd.) Candida sp. Penicillium sp. Mucor sp. Aspergillus sp.

4. Značaj gljiva u biotehnologiji • Biotehnologija primena naučnih i inženjerskih principa u procesuiranju sirovina pomoću bioloških agenasa u cilju dobijanja određenih dobara i proizvoda za ljude • Ranije primenjeni genetski inženjering i molekularna biologija • koriste se kao zdrava i lekovita hrana, • u proizvodnji pojedinih namirnica, • u farmaceutskoj industriji - antibiotici i drugi lekovi, • Izvori bioloških fungicida, regulatori rasta biljaka, • Izvori vitamina i enzima • proizvodnja sisarskih hormona i proteina.

5. Fermentaciona tehnologija Fermentaciona tehnologija se bavi korišćenjem širokog spektra mikroorganizama u fermentorima, kao i dobijanjem njihovih specifičnih produkata metabolizma sadržanim u ćelijama (intracelularno) samih mikroorganizama ili u medijumima (ekstracelularno) u kojima su oni gajeni. većina mikroorganizima koji se koriste u procesima fermentacione tehnologije jeste aerobno a ne anaerobno- pogrešan termin • Fermentaciona tehnologija podrazumeva nekoliko procesa: • laboratorijska istraživanja samih mikroorganizama i sirovina koje se koriste za njihovo gajenje, • optimum operacija u fermentorima odgovarajućeg dizajna, • kao i krajnji proces «prepravke» željenog produkta.

6. Preliminarna laboratorijska istraživanja • Izolacija mikroorganizma u cilju proizvodnje odgovarajućeg produkta • Takva kultura predaje onaj deo izvora ugljenika za proizvodnju metabolita u količini koja nije neophodna za njen opstanak • genetske manipulacije • istraživanja fiziologijemikrooorganizama, • medijum «čorba ili bujon» za gajenje mikroorganizama treba da omogući visoku stopu rasta, • dobar prinos organizama i traženog produkta • jeftina hranljiva podloga

7. Gajenje gljiva u erlenamjer posudama na laboratorijskoj rotacionoj tresilici

8. Povećanje obima fermentacije – “scale up” • Lab. fermentorizapreminenekolikolitara. • pilot (probni) processafermentorimazapremine 50ldonekoliko 1000 litara • Komercijalna proizvodnja fermentori zapremine od 100 ili 1000 litara • mešanje lopaticama (impelerima) i aeracija. • statičke kulture gde gljive rastu na površini u vidu mutne mase • i nestatične kulture hife u vidu peleta potopljenih u medijum • primenom submerzinih (potopljenih), prvi put dobijen i penicilin koji je bio jeftin

9. Laboratorijski bioreaktor (3l) za izvođenje diskontinualne, semikontinualne i kontinualne kultivacije (Groningen, Holandija)

10. Povećanje obima fermentacije – “scale up”

11. Povećanje obima fermentacije – “scale up” • poteškoćeuovimprocesima: • problemaeracije - ubacivanjekiseonikauzrokuje često penušanjemedijuma, • smanjuje se transferkiseonika- antipenušavci. • neke gljive se usled mešanja mogu fragmentisati, čime se remeti njihov normalan i kontinuiran rast. • obezbediti adekvatno hlađenje.

12. Čuvanje kultura • Soj gljive koji daje visok prinos nekog produkta je od neizmernog značaja. • master kulture koje su poreklom iz pojedinačne jednoćelijske, haploidne kulture (genetski uniformne) • duže čuvanje, kulture se prelivaju mineralnim uljem (medicinski parafin) koji sprečava gubitak vode, • čuvanjem komadića kultura sa podlogom u vodi. • zamrzavanje u tečnom azotu. • Suspenzija ćelija ili njihovih (bespolnih) spora se napravi u tečnosti sa npr. 10% glicerola ili DMSO (dimetil sulfoksid) sprečava formiranje ledenih kristala prilikom zamrzavanja. • čuvanje u specijalnim kontejnerima prelivene tečnim azotom i po nekoliko godina.

13. Pripremanje inokuluma • inokulum za proizvodne fermentacije mora biti oko 10% radne zapremine fermentora. • kosi agar • tečni hranljivi medijum. • kraj eksponencijalne faze rasta • inokulacija laboratorijskog fermentora. • Tokom čitavog procesa se proverava ispravnost tj. korektnost rasta kulture i prati njena čistoća

14. Medijumi i sirovine za fermentacione procese • hranljivi medijum treba da sadrži lako upotrebljiv izvor ugljenika, azota i drugih esencijalnih elemenata u odgovarajućim količinama i odnosima. • lako u laboratorijskim - mnogo teže u industrijskim procesima • izbor sirovine - ključni faktor uspeha • izvor ugljenika- lako usvojiv i jeftin • Gljive- glukoza, saharoza čiji su dobri izvori: • slatki sokovi, • nerafinisani šećer, • melasa – otpadna tečnost iz šećerana • i hidrolizovani dekstrin.

15. Medijumi i sirovine za fermentacione procese • Surutka- laktozu gljive teško usvajaju, iako se može koristiti kao dobar izvor azota. • Kukuruzno brašno- skrob i prečišćen skrob, se lako usvajaju i predstavljaju dobre sirovine za mnoge gljive • Celulozane predstavlja dobru sirovinu za fermentacije. • sem ugljenih hidrata izvori C mogu biti • biljna ulja kao što su sojino, palmino ili kukuruzno ulje.

16. Medijumi i sirovine za fermentacione procese • Izvori azota. • melasa šećerne repe, surutka, pored izvora ugljenika sadrže i odgovarajuću količinu azota. • Ako se mora dodavati najčešće u vidu kukuruznog ekstrakta (5% ukupnog azota). • Drugi nutrijenti potrebni za rast su • minerali, • vitamini (kvaščev ekstrakt) i • mikroelementi.

17. Tipovi i načini rada fermentora • engl. stirred tunk reactor je cilindrični sud • zagrevan je ili hlađen - sterilan • dodaju sirovine proverenog kvaliteta i • kulture gljiva, ne smeju biti kontaminirane. • od nerđajućeg čelika, da bi se izbegla korozija • Prvi put je dizajniran 1940. godine i od tada se veoma malo promenio.

18. Načini kultivacije gljiva • U laboratorijskim a i u industrijskim uslovima gljive se mogu gajiti u • diskontinualnim(nekontinuiranim, sa prekidima) i uslovi sredine u kojima se dešava rast kontinuirano se menjaju (pošto raste gustina ćelija, nutrijenti se troše i formiraju se produkti) • kontinualnim(kontinuiranim, neprekinutim) kulturama i optimalni uslovi održavaju tokom čitavog procesa,

19. Kontinualna kultivacija Prednosti: • visoka produktivnost kultura koje su sposobne dugo da rastu i da troše, što je moguće manje nutrijenata pri proizvodnji željenog proizvoda • Kontrola procesa • kada su potrebne velike količine nekog proizvoda (npr. etanola iz kvasaca) ili u slučaju kada je potrebno dobiti direktno neki rezultat rasta ćelija (npr. jednoćelijskog proteina-mikoproteina). • moraju se obezbediti odgovarajući izlazi proizvedenih produkata Nedostaci: • rizik od kontaminacije • genetička nepostojanost mikroorganiazama

20. Semikontinualna kultivacija (eng. fed batch cultivation) • Dodaje se sveža podloga • Traje dok se ne popuni radna zapremina fermentora • visok nivo glukoze sprečava sekundarni metabolizam. • Ovakav tip kulture se koristi često pri proizvodnji penicilina i drugih antibiotika.

21. Izolovanje i prečišćavanje proizvoda fermentacije Konačan proizvod: • Kulturelna tečnost – ekstracelularni medijum (npr. submerged mycelium) • Biomasa – masa ćelije kvasaca ili micelije • Problem: proizvoda ima jako malo • 1g traženog enzima ili 10 g antibiotika

22. Izolovanje i prečišćavanje proizvoda fermentacije • Flotacija • Filtracija • Sedimentacija • Centrifugiranje

23. Izolovanje i prečišćavanje proizvoda fermentacije Manipulacija biomasom Intaktne ćelije ili intracelularni enzimi - u presama, mlevenje, liza ćelijskog zida ili osmotski šok

24. Fermentacija na čvrstim podlogama Tradicionalna azijska fermentacija hrane vrši se na čvrstim podlogama. Plesni se koriste za razgradnju materijala biljnog porekla (sojina i pšenična zrna). Ekstracelularni enzimi razgrađuju polimere kao što je celuloza (soja sos, miso i tempeh) • mlevenje i usitnjavanje biljnog materijala • potapanje • Izlaganje vodenoj pari • nizak sadržaj vode

25. Fermentacija na čvrstim podlogama Gajenje pečuraka i kompostiranje organskog otpada spada u fermentacije na čvrstim podlogama. tehnologija gajenja gljiva na čvrstom supstratu je posebno razvijena u Japanu, proizvode se: limunska i neke druge organske kiseline, i enzimi Prednosti jeftine sirovine, nije neophodna sterilizacija, potrebe za energijom su male, a otpad je kompaktan i u polučvrstom stanju. Nedostaci proces fermentacije sporiji

26. Enzimi gljiva od komercijalnog značaja • ekstracelularni enzimi koji razgrađuju polisaharide i proteine u šećere i amino kiseline koji se lako mogu asimilovati. • hidroliza skroba, umesto kiselinske hidrolize, • β-1-3-glukanaza (Aspergillusniger) uklanjanje mutnoće piva razgradnjama glukana, • pektinaza za uklanjanje mutnoće kod vina, • laktaza(Kluyveromyces) koja degradira laktozu do glukoze i galaktoze i koristi se umesto zaslađivača sladoleda • celulaza (Trichoderma)

27. Enzimi gljiva od komercijalnog značaja Proteazesu kisele. • himozin (Rhizomucor miehi, Rhizomucor pusillus), -proizvodnja sireva • Protezama se uklanja i gluten iz brašna što pospešuje kvalitet biskvitnog brašna • Nukleaze (Penicilliumcitrinum) i lipaze (Aspergillusoryzae) se takođe često upotrebljavaju. • Nukleotidi su odgovorni za postizanje mesnog ukusa, a masne kiseline utiču na ukus sireva.

28. Imobilizacija enzima i slobodne i imobilizirane ćelije da bi se osigurao ravnomeran raspored i dugo zadržavanje u medijumu proteaza i enzima koji razgrađuju skrob vrši se Imobilizacija na nosačima: • neorganski (keramika), • prirodni polimeri (celuloza), ili • sintetički polimeri (najlon).

29. Imobilizacija enzima i slobodne i imobilizirane ćelije vezivanje jonskim ili kovalentnim vezama ili alternativnim putem: hvatanjem enzima u porozni matriks polimera ili unutar polupropustljive membrane

30. Proizvodnja alkoholnih pića C6H12O62C2H5OH + 2CO2 • Saccharomycescerevisiae i njegovi varijeteti S. carlsbergensis i S.ellipsoideus). Prema proceduri proizvodnje, sva alkoholna pića se klasifikuju u tri grupe: • Pića dobijena fermentacijom voćnog soka bogatog šećerima (vina, jabukovo vino) • Pića napravljena iz materija bogatih skrobom (pivo) • Pića proizvedena korišćenjem destilacije (alkoholna pića i pojačana vina)

31. Vino • Pri proizvodnji belih vina, dodatni mehanički pritisak cedi sok iz pulpe, a kožica se uklanja, • pri proizvodnji crnih vina kožica ostavlja da fermentiše zajedno sa sokom. • crna vina bogatija taninima kojima se pripisuju antioksidantna svojstva. • Roze vina se samo na kratko ostavljaju u kontaktu sa ljuskom zrna grožđa ili se dobijaju mešanjem belih i crnih vina.

32. Vino

33. Vino • Fermentacija u buradima ili otvorenim sudovima, iako se u poslednje vreme sve više koriste fermontori sa striktno kontrolisanim uslovima • Kvasac S.elipsoideus, • Fermentacija se odvija dok koncentracija alkohola ne dostigne 10-12% (v/v), kada naglo prestaje. • koliko je šećera preostalo dobijaju se, • slatka, umerena ili suva vina. • viši alkoholi, organske kiseline, isparljivih etil-estara koji su odgovorni za aromu vina, glicerol (1%) i malična i tartarična kiselina.

34. Kultivacija gljiva za ishranu • Gljive su dobri izvori vitamina, amino-kiselina i lipida. • Makrogljive se gaje da bi proizvele krupna plodna tela, dok se kvasci i plesni gaje u fermentorima (za proizvodnju jednoćelijskih proteina) • Pečurke i druge makrogljive • Proizvodnja makrogljiva je jedini profitabilni način upotrebe do sada neikorišćenih rezervi lignoceluloznog otpada. Ovaj fenomen prerasta u razmere tzv. «nezelene revolucije»

35. Kultivacija gljiva za ishranu • šampinjonAgaricusbisporus, gajen nekad nakonjskojbalegiubaštama, pećinamairudnicima, • danas se gajiuspecijalnimgajilištima, sagodišnjomsvetskomproizvodnjomodokodvamilionatona

36. Kultivacija gljiva za ishranu • kompostiranje, tj. pripremaodgovarajućegmedijumazarast, štotrajeoko 10-14 dana • slediprocesgajenjakojitraje 9-11 nedelja. • Kompost-slama + konjskabalega • Mešanjem serazvijamikrofloraaktinomicetaidrugihbakterija • Proces kompostiranja se završava u specijalnim komorama na 60ºC. • podstiče razvoj termofilnih vrsta, a efekti pasterizacije ubijaju mezofilne organizme koji bi kasnije bili u kompeticiji sa micelijom gljive Agaricus.

37. Kultivacija gljiva za ishranu • nestanak nutrijenata sa malom molekulskom težinom, • Nakon inokulacije inkubacija se dešava na 25ºC, i posle 10-14 dana, kompost je potpuno kolonizovan. • plodna tela se javljaju u intervalima od 7-10 dana u narednih 5 nedelja. Posle toga se prostorija čisti parom do 60ºC, da se unište patogeni mikororganizmi, a prestali kompost se daje za upotrebu u hortikulturi ili u baštama

38. Kultivacija gljiva za ishranu • Pored Agaricusbisporus i Lentinusedodes, još se gaje:Volvariavolvacea, (u Kini se gaji više od 2000 godina, a za kompost se koristi pirinčana slama i pamučni otpad), • Flammulinavelutipes koja se gaji u plastičnim flašama i na piljevini i mekinjama pirinča, • Pleurotusostreatus na različitim supstratima, • Pholiotanameko, Auricularia i Tremella koje se masovno gaje u Kini i Tajvanu • Većina ovih gljiva se proizvodi da bi se koristila njihova plodna tela za ishranu. Radi se o saprofitima i to pre svega razgrađivačima drveta.

39. Jestiva biomasa kvasaca i plesni - jednoćelijski proteini • Veliki deo ljudske populacije neuhranjen, • Biljke imaju relativno mali sadržaj proteina • Mnogi mikroorganizmi su sposobni da koriste jeftine i lako dostupne izvore azota i izvore ugljenika poput skroba, prirodnog gasa i naftnih ugljovodonika. • Biomasa gajenih mikroorganizama ima visok sadržaj proteina. • masovna proizvodnja mikrobne biomase za ljudsku i životinjsku upotrebu. • biomasa mikroorganizama se obično naziva jenoćelijski protein ili na engleskom «single cell protein» (SCP) .

40. Mikoprotein • U Velikoj Britaniji gljiva Fusarium graminearum se koristi za proizvodnju mikoproteina - Quorn™mikoprotein

41. Mikoprotein • Micelija simulira teksturu mesa i zadovoljava potrebe organizma za proteinima. • lipida manje nego u mesune sadrži holesterol • Proizvodnja - kontinualnim kulturama u kolonskim fermentorima sa vazdušnim mešanjem (air lift fermenters). • Fermentacija traje 6 nedelja. • pojava jako granajućih mutanata koji ne zadovoljavaju teksturu samog proizvoda. • Mikoprotein je veoma adsorptivan i zadržava ukus i boju tokom kuvanja.

42. Korišćenjegljivauprehrambenoj industriji • Hleb • Saccharomycescerevisiae. • Prpoizvodnja – semikontiunalna kultivacija • ćelijeseuklanjajuvakuumfiltracijom • pšeničnobrašnokojesadržigluten, • Voda i kvasac (2%-6%), • soli (1,5-2%) i • Poslemešanja, testoseostavljadaodstojinekolikosati. • Pečenje • kvasciSaccharomycesexiguus, S. cerevisiae, CandidakruseiiPichiasaitoislužezaproizvodnjuraženoghlebakojisedobijaodmešavinepšeničnogiraženogbrašna.

43. Proizvodi od soje • Soja sos • Sojinazrnasenajprepotapaju, ljušteikuvaju. • aerobnafermentacijana čvrstomsupstratu-Aspegillusoryzae. • mešavinagljiveisupstratakojasezovekoji. • Plesanprodukujevelikukoličinuhidrolitičkihenzima • Fermentacijakojijausavremenojproizvodnjitraje 3 danaiprekidaseprenego štogljivasporuliše. • Ovamešavinasespajasaslanomvodomsaoko 20% solipri čemusedobijemoromi. • anaerobnafermentacija(halotolerantnikvasci + mlečnokiselinskebakterije. • Inkubacijatrajeod 3 mesecado 3 godine. • Nakrajufermentacijeodvajasetečnideo, pasterizujeseipakujeuflaše.

44. Proizvodi od soje • Misopastapravi se od sojinihzrnaipirinča, sojinihzrnaiječmailisamoodsoje. • Pirinač senatopi, popari, inokulišesaA. oryzae, inkubirasedvadanana 28oC. • Potomsesvepomešasanatopljenimipoparenimzrnimasoje. Nakondodatkasolimoromistadijumzapočinje čistomkulturomZygosaccharomycesrouxiiilisastarterkulturompotpunofermenisanogmisa. • fermentira nedelju dana na 28oC, • dva meseca na 35oC, i • potom dve nedelje na sobnoj temperaturi. • Miso je u vegetarijanskoj ishrani dobar izvor vitamina i proteina.

45. Sir i fermentisano mleko • U proizvodnji sira mleko se inokuliše sa starter kulturom mlečnokiselinskih bakterija. • dodaje se enzim renin koji izaziva formiranje sira. • U novije vreme se umesto telećeg sve više koristi renin dobijen iz gljiva. • Nakon zgrušavanja mleka novonastali sir se odvaja od surutke. • Različiti mikroorganizmi mogu biti uključeni u proces sazrevanja sira. • Postoje dva osnovna tipa sireva za koje su odgovorne gljive: Kamember sirevi i plavi sirevi Rokfor tip.

46. Meki sirevi sa plesnima • Kamember, bri, thenaj, troj i vendom su sirevi koji su inokulisani sa Penicilliumcamambertii i Penicilliumcaseiolum. • Bela micelija daje površini brija i kamembera karakterističan izgled, ali nikada ne prodiru u unutrašnjost. • Proteolitički enzimi difunduju u gruš razlažući proteine u peptide i aminokiseline izazivajući omekšavanje sira. • Lipaze oslobađaju masne kiseline koje mogu biti konvertovane u metilketone koji daju siru specifičan ukus i miris.

47. Meki sirevi sa plesnima • Plavi sirevi Rokfort, stilton, gorgonzola, danski plavi sir i venslidejl su inokulisani Penicillium roquefortii. • U usireno mleko se ubacuju hlebne mrvice sa micelijom plesni P. roquefortii , a zatim se inkubira dok sir ne sazri. • Ova plesan može da toleriše visoke koncentracije CO2 i niske koncentracije O2, • Plavo zelena boja koja se dobija potiče od velikog broja konidija. • Ne menja se samo izgled, već i ukus sira. Plesan oksiduje masne kiseline do metil ketona, naročito 2-heptanona koji je odgovoran za specifičan ukus i miris ovog sira.