Técnicas para evaluar Inmunodeficiencias

1. Técnicas para evaluar Inmunodeficiencias Inmunología Aplicada 1065 Carolina Hernández Martínez Formación de profesores 2005 Supervisado por Ma. Dolores Lastra

2. Biometría Hemática • Número total de eritrocitos, plaquetas, linfocitos, monocitos y granulocitos. • Linfocitos B: CD18,CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD43, CD44 Linfocitos T: CD3, CD4, CD8, CD18, CD25, CD43, CD44 Células NK: CD56, CD16, CD18, CD43, CD44 Neutrófilos: CD11a, CD63 Monocitos-Macrófagos: CD14, CD18, CD23, CD25, CD43, CD44

3. Función de las células T • Pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada. • Estudios funcionales in vitro. • Respuesta linfoproliferativa. • Produción de mediadores: citocinas. • Citotoxicidad T CD8+. • Citotoxicidad NK.

4. Prueba de hipersensibilidad retardada

5. Respuesta linfoproliferativa • Consiste en cultivar linfocitos del paciente con los antígenos que quieren ser evaluados o estudiados y con varios mitógenos que se utilizan como control de la inmunoproliferación (estimulación no específica). La transformación blástica específica se mide por la capacidad que tiene el antígeno de inducir la proliferación linfocitaria.

7. Rosetas con los eritrocitos Los linfocitos T presentan la característica de formar rosetas cuando se unen a los eritrocitos de carnero . Se pueden cuantificar los linfocitos T incubándolos con eritrocitos de carnero (reconocimiento de moléculas CD2+ y CD58+) y la posterior observación al microscopio se numeran las rosetas (entre 70 y 80% positivas en pacientes normales).

9. ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS LINFOCITOS T (CD 8+) • La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD 8+) frente a una célula blanco se puede estudiar, midiendo la capacidad de destrucción, que un determinado número de linfocitos T tienen para destruir un determinado número de células blanco, al estar ambas poblaciones en contacto. Se puede medir mediante la liberación de Cr51 por las células blanco previamente marcadas.

10. Citotoxicidad NK • En esta prueba se mide la capacidad de estas células para matar células blanco especiales (K562). La citotoxicidad suele determinarse mediante el uso de Cr51. • Por citometría de flujo se determina la actividad de estas células utilizando los marcadores específicos.

12. Subpoblaciones de T • Mediante anticuerpos monoclonales se pueden marcar las diferentes poblaciones linfocitarias: • Linfocitos Th: CD4+ • Linfocitos Tc: CD8+ Las mediciones obtenidas se indican en porcentajes de cada población. • Se pueden utilizar otros marcadores.

14. Evaluación de la Fagocitosis

15. Índice Fagocítico. Determina la capacidad de fagocitar de los leucocitos, pero no el poder para digerir las partículas fagocitadas. • Actividad bactericida. Complementa la prueba anterior y determina si las bacterias fagocitadas son o no destruidas por las lisozimas de los fagosomas de los leucocitos.

17. Prueba del NBT • Es posible observar la reducción del nitroazul de tetrazolio (NBT) debido a que éste acepta un protón, cambiando su típica coloración amarilla transparente por un azul intens (azul formazán).

18. Prueba de la reducción de dihidrorodamina (DHR). • Los fagocitos reducen el DHR a un compuesto fluorescente en individuos sanos. Al no haber presencia de fluorescencia se suele tratar de una EGC ligada al X, pero con presencia en bajas cantidades, hablamos usualmente de una AR.

19. Eritrofagocitosis Se basa en la cuantificación de la hemoglobina liberada por los eritrocitos que han sido fagocitados utilizando un espectrofotómetro. En una placa, se colocan una concentración conocida de macrófagos del paciente en seis pozos, se incuban. Se coloca SRBC opsonizados (es decir, unidos al complemento o IgG) y sin opsonizar, se incuban. Se añade el sustrato y se mide la absorbancia.

20. Eritrofagocitosis

21. Ventana cutánea de Rebuck. Normalmente se presenta un acúmulo de PMN en las primeras 6 horas, después es sustituido por uno de linfocitos (poco utilizada).

22. Quimiotaxia • Se basan en medir la locomoción direccional de los neutrófilos hacia diversos estímulos quimiotácticos: Cámara de Boyden.

23. Quimioluminiscencia Los neutrófilos emiten pequeñas cantidades de radiación electromagnética después de la ingestión de microorganismos. Durante la explosión respiratoria se genera oxígeno molecular (inestable y muy reactivo) se combina con bacterias u otros elementos intralisosómicos formando grupos carboxilo de inestabilidad electrónica. Cuando estos grupos regresan a su estado basal, emiten energía lumínica.

25. Evaluación General de la Inmunidad Mediada por Anticuerpos Métodos Inmunológicos utilizados para identificar anormalidades fenotípicas y defectos genéticos y moleculares Evaluación fenotípica Concentración de Inmunoglobulinas en suero Subclases de IgG Anticuerpos específicos Anticuerpos antiproteínas Anticuerpos contra tétanos y difteria Anticuerpos contra H influenza Anticuerpos antipolisacárido Isohematoaglutininas Anticuerpos contra el polisacárido del neumococo Anticuerpos antibacteriófago Enumeración Células B (poca aplicación) Evaluación de la función de células T Evaluación de defectos genéticos y moleculares Detección de defectos moleculares en células B y T Identificación de anormalidades genéticas

27. Pruebas para células B • Proteínas (Electroforesis) • IgA,IgE • Isohematoaglutininas AB (IgM) • Anticuerpos antitoxoide tetánico (función IgM) • Anticuerpos antitoxoide diftérico (función IgG) • Anticuerpos anti candida • Anticuerpos anti pneumococo • Antígeno CD20 (función de células B) • Subclases de IgG