Forum Biotech, Analytica 2010 Dr. Hanswilly Müller Sensovation

1. Vorteile eines colorimetrischen „Array-in-Well“ Assays, dargestellt am Beispiel der Multiplexed Diagnostik der Atemwege. Forum Biotech, Analytica 2010 Dr. Hanswilly Müller Sensovation

2. Gliederung • Einführung, Begriffserklärung, Motivation • Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich • Colorimetrische Fluoreszenz Detektion • Multiplex Modell – Assay • Colorimetrischer Assay zum Nachweis von • Grippeviren • Assay-Entwicklung und Validierungan Patientenproben

3. Gliederung • Einführung, Begriffserklärung, Motivation • Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich • Colorimetrische Fluoreszenz Detektion • Multiplex Modell – Assay • Colorimetrischer Assay zum Nachweis von • Grippeviren • Assay Entwicklung und Validierungan Patientenproben

4. Multiplexing • Trend zurpersonalisiertenMedizinerfordertbessere,mehrund häufigerediagnostischeUntersuchungen • SimultaneMessungverschiedenerParameter in einer Probe • Proteine, DNA • Etablierte Multiplexing Techniken: • Planare Microarrays hoherDichte: DNA arrays • Bead-basierterAnsatzmitDurchflusszytometrie (bis zu100-plex) • Unser Ansatz: Planare Microarrays in 96 Well Platten • Arrays geringerDichte (z.B. 9 bis ca. 144 Spots pro Microarray) • Ideal für den Nachweis von Protein-Markern, Genotypisierung • Colorimetrische- und FluoreszenzDetektion Multiplexed Diagnostics

5. CLAIR®: Colorimetric Array Imaging Reader für Microarrays • CCD-basierter Imaging Reader • Geeigentfür IVD • EigenständigesGerät • MiteingebautemRechner, Kontroll-Software, Touch-Screen und integrierter Spot Auswertung • Für die quantitative Auswertung von Microarrays • Spot Größen von 50 – 500 µm • SchnelleBildaufnahme • Ca. 2 Minuten pro Mikroplatte • Flexible Probenformate • 96-well Platte, Strip-well Platte, Objektträger

6. Gliederung • Einführung, Begriffserklärung, Motivation • Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich • Colorimetrische Fluoreszenz Detektion • Multiplex Modell – Assay • Colorimetrischer Assay zum Nachweis von • Grippeviren • Assay Entwicklung und Validierungan Patientenproben Durchgeführt in Zusammenarbeitmit VTT, Turku, Finland

7. „Arrays in Well“ Plattformmit fluorogenen oder colorimetrischen Substraten • Arrays in Well (AIW) • Microarrays in 96-Well Platten • Multi-Analyt basierte Bioassays im einfachen und vertrauten Mikroplatten Format (C) 2009 Sensovation AG

8. Prinzip: Array in Well

9. Prinzip von Fluoreszenz, VerstärkteFluoreszenz und Colorimetrie Direkte Fluoreszenz Markierter Antikörper Antigen Fänger Antikörper Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

10. Prinzip von Fluoreszenz, VerstärkteFluoreszenz und Colorimetrie Verstärkte (Amplified) Fluoreszenz (Tyramide) HRP HRP HRP CY3 CY3 CY3 CY3 H202 Markierter Antikörper CY3 CY3 CY3 CY3 CY3 CY3 Antigen Fänger Antikörper Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

11. Prinzip von Fluoreszenz, VerstärkteFluoreszenz und Colorimetrie Colorimetrie HRP HRP HRP TMB TMB TMB TMB H202 Markierter Antikörper TMB Antigen TMB TMB TMB Fänger Antikörper TMB TMB TMB Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

12. TechnologieVergleichanhandeinesModell Assays: CLAIR vs. Confocal Scanning • FärbeTechnik: ColorimetrieimVergleichzudirekterFluoreszenzimVergleichzuverstärkterFluoreszenz • Reader Technologie: CLAIRTecan LS400 • =>CCD-Imager Laser Scanner • Modell Assay • Adenovirus Hexon Protein (Virus Antigen) • Verdünnungsreihe von 156 ng/mlbis 0.0009 ng/ml, plus Leerwert • Multiplexed Sandwich ELISA • Doppelbestimmung • JedesNäpfchenenthielteineAnordnung von 3 x 3 Spots Array Layout

13. CLAIR Konfokaler Scanner, Bilder VerstärkteFluoreszenz Colorimetrische Detektion DirekteFluoreszenz

14. CLAIR Konfokaler Scanner, S / N Vergleich Färbung / Reader • VerstärkteFluoreszenz(Cy3) ist die empfind-lichsteMethode, Detektionsgrenze: 0.016 ng/ml • DirekteFluoreszenz(Dy633) istetwa 2x wenigerempfindlich • TMB Assay Detektions-grenze: 0.041 ng/ml. Schlussfolgerung: Cy3/TECAN doppelt so empfindlichwieDy633/TECAN welchedoppelt so empfindllichistwieTMB/CLAIR.

15. CLAIR Konfokaler Scanner, Diskussion • Empfindlichkeit: • Colorimetrischer TMB-Assay istnur ca. 2-mal bzw. 4-mal wenigerempfindlichalsdirekte / verstärkteFluoreszenz • DynamischerBereich: • Colorimetrischer Assay hatteeinesehrguteLinearitätüber 2 Größenordnungen • VerstärkteFluoreszenzhatteeinengeringerendynamischenBereichals die colorimetrischeMessung • DirekteFluoreszenzhatteeineguteLinearitätüber 3 Größenordnungen • Beachte: DieserVergleichbeinhaltetFärbetechnik, kombiniertmitDetektionstechnik: High End Forschungs - Scanner (Fluoreszenz) gegenübereinem Routine-Reader (Colorimetrie)

16. Gliederung • Einführung, Begriffserklärung, Motivation • Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich • Colorimetrische Fluoreszenz Detektion • Multiplex Modell – Assay • Colorimetrischer Assay zum Nachweis von • Grippeviren • Assay Entwicklung und Validierungan Patientenproben Durchgeführt in Zusammenarbeitmit VTT, Turku, Finland

17. Multiplexed Virus Assay • Test von Grippeviren • Multiplexed Analyse von 7 Grippeviren • Sandwich ELISA Assay • ColorimetrischesAuslesenmit CLAIR Reader • Verdünnungen von Virus-Infiziertem Zell-Lysat • Array Layout Adenovirus, RespiratorySyncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B (InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)

18. Multiplexed Virus Assay, Bilder Beispiele • Schlussfolgerung: • Mitdemmultiplex Assay konntenalle 46 analysierten Virus-Probendetektiert und korrektklassifiziertwerden. • Das Auslesen und die AuswertungmitCLAIR war schnell und einfach. Die Analytikisteinfachautomatisierbar.

19. AnalyseklinischerProben • AnalysedergenanntenGrippeviren in 88 klinischenPatientenprobenmittelseines multiplex Assay • Die Patientenprobenwurden parallel analysiert • Mittelscolorimetrischer TMB-Detektion (CLAIR) • MittelsverstärkterFluoreszenz (Laser Sanner, TECAN) • Die Pateintenprobenwarenzuvormittels TR-FIA getestetworden: 44 Probenwaren Antigen-negativ, 44 waren Antigen-positiv: Adenovirus, RespiratorySyncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B (InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)

20. AnalyseklinischerProben • Array Layout • JederFänger-Antikörperwurde 6 mal gespottet: • Drei Spots mithoherAntikörper- Dichte • Drei Spots mitgeringererAntikörper- Dichte • Erhöhung des dynamischenBereichs, daeinigeProbenmithoher Antigen Konzen-trationKreuzreaktionzeigten • Positive Kontrollenin allenvierEcken • DienenauchalsReferenz-Spots für das Grid beiderautomatischenAuswertung

21. AnalyseklinischerProben, Bilder DirekterVergleich TMB/CLAIR und Cy3/TECAN

22. AnalyseklinischerProben, Ergebnisse • Colorimetrische Detektion (CLAIR) liefertevergleichbareErgebnissezudemFluoreszenz-Test (verstärkteFluoreszenz), gemessenmitdemTecan LS400 • Tecan / Fluoreszenzcharakterisierte 82 von 88 Probenrichtig (gemessen an der TR-FIA Referenzmethode) • CLAIR / Colorimetriecharakterisierte 77 von 88 Probenrichtig (gemessen an der TR-FIA Referenzmethode) • AllefalschcharakterisierteProbenwaren PIV 3 Proben, die offenbarmitderZeitdegradiertwaren (TR-FIA MessungenfandenmehrereWochenfrüherstatt) • MitFluoreszenzwurden die Probengeradeüberdem “Cut-Off” gemessen • MitColorimetriewurden die Probengeradeunterdem “Cut-Off” gemessen  Die genaue Antigen-KonzentrationzumZeitpunkt dieses Experi-mentesistunbekannt und könnteunterdem “Cut-Off” gelegenhaben

23. Zusammenfassung • Colorimetrische DetektionistimErgebnisvergleichbarmitFluoreszenz-Detektion (verstärkteFluoreszenz) • VergleichbareEmpfindlichkeit und Linearität • Fluoreszenz Assays könneneinfach in colorimetrische Assays “umgebaut” werden • Colorimetrische Assays und die dafürnotwendigenGerätesindwenigerkomplex und preisgünstigerals die entspechendenFluoreszenz-Geräte • Colorimetrische Assays sind ideal für die Routineanalytik in klinischen Labors, Veterinärmedizin und Lebensmittel-analytik

24. BesuchenSieuns auf derAnalytica Halle 2, Stand 524 DankefürIhrInteresse!