Microscopía de Fluorescencia

1. Microscopía de Fluorescencia

2. Microscopía de Fluorescencia. Fluorescencia: propiedad que poseen determinadas sustancias ( fluorescentes )de emitir, bajo la acción de radiaciones de onda corta, otras radiaciones de longitud de onda más larga. 0.11 180 340 750 400 . 103 Espectro Electromagnético Ultravioleta Infrarrojo Rayos Gamma RayosX Visible Microondas Longitud de onda

3. Microscopía de Fluorescencia Colorantes Fluorescentes: cuando se exponen a la luz ultravioleta, se perciben como un cuerpo brillante sobre fondo oscuro. El color y la intensidad de luz que emiten es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada. Los colorantes fluorescentes utilizados en la tinción de muestras clínicas, son detectados con ayuda del Microscopio de Fluorescencia.

4. Microscopio de Fluorescencia-Contraste de Fases

5. Tipos de Microscopía de Fluorescencia • Primaria. La propia muestra posee fluorescencia. • Secundaria: muestra marcada con colorantes fluorescentes. • Inmunofluorescencia: la fijación del colorante fluorescente se realiza con un anticuerpo marcado.

6. Inmunofluorescencia La base de una prueba inmunológica es la reacción Antígeno-Anticuerpo. Antígeno: también llamados inmunógenos, son cualquier material que estimula la formación de un anticuerpo. En su mayoría son sustancias proteicas Determinante Antigénico: la parte por la que un antígeno se une al anticuerpo. Hapteno: pequeñas moléculas que no son capaces por sí solas de estimular la formación de anticuerpos, pero que unidas a otras moléculas más grandes, sí lo hacen. Inmunoglobulinas: proteínas cuya característica definitoria es que en ellas reside la actividad de anticuerpo.

7. Inmunofluorescencia:Anticuerpos: Estructura.

8. Anticuerpos Funciones: • Reconocer un determinado antígeno y combinarse con él. Esta característica depende del idiotipo ó región variable. • Desencadenar una serie de consecuencias tras la unión con el antígeno, lo cual depende de la región constante. Según el tipo de inmunoglobulina, existen distintas posibilidades como capacidad de atravesar la placenta ó no, distribución por el organismo, capacidad de fijarse a la superficie de determinadas células, capacidad de activar el complemento, etc.

9. Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia Directa: Son ensayos que están limitados a la detección de antígeno, y que permiten el diagnóstico de enfermedades bacterianas, fúngicas, parasitarias y virales. Consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante reacción directa con un un anticuerpo específico, marcado con colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a través de la inoculación del microscopio productor del antígeno en un modelo animal Es un método simple y rápido de realizar, con pocas reacciones inespecíficas, sin embargo es menos sensible.

10. Inmunofluorescencia Directa

11. Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia Indirecta. Se puede usar tanto para la detección de antígenos como de anticuerpos. Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato que puede ser un antígeno u otro anticuerpo, y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo.( por ejemplo : hepatocitos ó células Hep-2 si buscamos anticuerpos antinucleares, ó leishmanias si buscamos anticuerpos antileishmania, células que contienen virus, Toxoplasma gondii, ó Treponema pallidum si buscamos anticuerpos contra estos agentes infecciosos ) Este método es más sensible y produce una fluorescencia de mayor brillo, sin embargo es menos específico y puede dar lugar a mayor reactividad cruzada.

12. Inmunofluorescencia Indirecta

13. Inmunofluorescencia Indirecta: detección de Antígeno.

14. Fluorocromos. Son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando captan ( son excitados por ) un fotón incidente de una longitu de onda característica. Ejemplos: Isotiocianato de fluoresceína: verde manzana. Rodamina: Naranja brillante. Características: • Forman uniones con las proteínas pero sin afectar los grupos de combinación específica del anticuerpo. • La fluorescencia se ve afectada por el pH • El fenómeno de “ fijación “ disminuye la fluorescencia en 15% a 30% con respecto al colorante libre • Las grandes intensidades de luz empleada, provocan también el desvanecimiento de la fluorescencia.

15. Imágenes Teñidas con Fluorocromos Neisseria Mycobacterium Treponema Borrelia