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Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia

Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia. Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014. Introducción. RT-PCR. Sondas de ADN. Ensayos de fluorescencia. Compuestos fluorescentes. Tinción celular. Ensayos de intercalación.

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Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia

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Presentation Transcript

  1. Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014

  2. Introducción RT-PCR Sondas de ADN Ensayos de fluorescencia Compuestos fluorescentes Tinción celular Ensayos de intercalación Ensayos de actividad antiproliferativa Intercalantes de ADN Quimioteca de compuestos catiónicos Potencial antitumoral Ensayos de selectividad de secuencia Bases estructurales de selectividad

  3. Introducción • Quinolizinio • Sistemas tri , tetra y pentacíclicos • Variación de forma y tamaño

  4. Síntesis • Condensación de Westphal Westphal, O.; Jahn, K.; Heffe, W. Arch. Pharm.1961, 294, 37-45. J. J. Vaquero, J. Alvarez-Builla, Adv. Nitrogen Heterocycles, 2000, 159-245 F. Delgado, L. Linares, R. Alajarín, J. Alvarez-Builla, J.J. Vaquero,Org. Lettt. 2006, 4057-4060

  5. Síntesis • Metátesis de cierre de anillo Grubbs 2º generación Hoveyda-Grubbs Núñez; B. Abarca; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. J. Org. Chem. 74, 4166 – 4176, 2009 A. Nuñez, A. M. Cuadro, J. Alvarez-Builla, J. J. Vaquero. Org. Lett. 2007, 9, 2977-2980 A. Núñez; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. Chem. Comm. 3, 2690 – 2692, 2006

  6. Ensayos • Intercalación / selectividad de secuencia de ADN • Curvas de fusión • Oligonucleótidos de secuencia definida • Ligando unido: aumento de temperatura de fusión Ensayo de selectividad de secuencia ADN (preferencia AT vs GC) Ensayo de Intercalación con el ADN Intercalantes de ADN Quimioteca de compuestos catiónicos Selectividad vs estructura V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo  A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling  Enviado A. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010

  7. Ensayos • Intercalación / selectividad de secuencia de ADN • Curvas de fusión • Oligonucleótidos de secuencia definida • Ligando unido: aumento de temperatura de fusión V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo  A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling  Enviado A. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010

  8. Ensayos • Intercalación / selectividad de secuencia de ADN

  9. Ensayos • Fluorescencia:

  10. Ensayos 6 12 1

  11. Valoración Fluorescencia • Materiales • Cromóforos (5% DMSO, 3,9·10-5M) • DNA Timo bovino (10 µl, 4,1·10-3M) • Procedimiento • Adición de alicuotas de DNA sobre disolución de cromóforo • Tiempo de intercalación: 10 min • Error correspondiente a dilución menor del 5% • Ratio 1:12 cromóforo/DNA

  12. Valoración Fluorescencia • Gráficas 12 1

  13. Valoración Fluorescencia 12 • Gráficas • Área bajo la curva • Anisotropía de fluorescencia • Constante de unión al DNA Kb= (6.92.6) 104 M-1 • Pares de bases por cromóforo (n): 5.90.3 1

  14. Dicroísmo circular inducido • Luz polarizada en un plano • Plano formado por 2 componentesen fase • Dicroísmo circular inducido: Transferencia de asimetría • Cercanía en el espacio • Molécula capaz absorber

  15. Dicroísmo circular inducido • Gráficas • Señal correspondiente al apilamiento de bases y a helicidad. • CD aumenta en presencia de cromóforo • Este cambio sugiere intercalación

  16. Dicroísmo circular inducido • Gráficas

  17. Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998 Dyes and pigments 96 (2013) 554-562

  18. Nuevos cromóforos Dyes and pigments 96 (2013) 554-562

  19. Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998

  20. Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998

  21. Nuevos cromóforos • Perspectivas • Cromóforos funcionalizados • Compuestos con un aumento de fluorescencia al estar unidos al DNA

  22. Síntesis del Híbrido Losartán-inhibidor de RAS

  23. Híbrido de Losartán • Introducción • Losartán • Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona • ARAII • Inhibidor de RAS • Proteína reguladora • Proteína G monomérica • Activación y proliferación • Objetivo • Estrategia

  24. Híbrido de Losartán • Síntesis del inhibidor de RAS J. Med. Chem. 2010, 53, 6838–6850

  25. Híbrido de Losartán • Oxidación de Losartán A. Avenoza et al. Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 949-957

  26. Híbrido de Losartán • Síntesis del Híbrido Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

  27. Híbrido de Losartán • Desprotección del Híbrido Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

  28. Híbrido de Losartán • Perspectivas • Desprotección del grupo tritilo utilizando Pt/C 5% • Se evita la deshalogenación. Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

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