RH si RIH

1. RH si RIH

2. RH - principiu • unele virusuri pot fi recunoscute prin capacitatea lor de aglutina diverse specii de H de păsări şi mamifere. • Este o R care permite evidenţierea şi titrarea de antigen viral.

3. RH • Prezenţa proprietăţii hemaglutinante într-un produs patologic (sau alt material cum este lichidul alantoidian - LAT) poate sugera prezenţa unui virus care are această proprietate, fără a putea identifica virusul în cauză. • Frecvent există însă activităţi hemaglutinante proprii substratului de replicare al virusului (ex. membrana chorioalantoidiană - MCA) ceea ce oferă un rezultate fals pozitiv.

4. RH • Intotdeauna, din PP recoltate de la bolnav sau din substraturile biologice de cultivare, activitatea hemaglutinantă trebuie identificată printr-o reacţie de inhibare a hemaglutinării (RIH). • In mod curent, RIH este mai utilă pentru identificarea Ac IH, fiind una din cele mai frecvente metode folosite în virusologie.

5. RH • Hemaglutinarea se realizează cu hematii provenind de la specii diferite, în funcţie de virusul în cauză. • Capacitatea hemaglutinantă se exprimă diferit , uneori în condiţii stricte de pH şi temperatură, condiţii prin care se poate realiza diferenţierea agenţilor respectivi (ex. arbovirusuri).

6. RH (exemple) • Virusuri gripale: hematii -cocoş, cobai • pH: 7.2 • Temperatura: 22ºC (A şi B);4 ºC (tipul C) • Virusuri paragripale • Hematii: cocoş, cobai • pH: 6.8- 7.2 • Temperatura: 4ºC ;22ºC sau 37ºC (cobai)

7. Hematiile • In privinţă hematiilor, pe lângă spectrul diferit de acţiune pe care îl are un anumit virus asupra hematiilor care provin de la diferite specii, uneori acesta este diferit în funcţie de vârsta sursei (ex. unele poxvirusuri necesită hematii de la păsări adulte, altele, hematii de la pui de o zi); • acelaşi virus aglutinează diferit hematii provenind de la indivizi din aceeaşi specie (ex. titruri hemaglutinante diferite ale aceluiaşi Ag urlian în prezenţa hematiilor obţinute de la cocoşi diferiţi), după cum îmbătrânirea şi recoltările prea frecvente de la acelaşi individ, conduc la scăderea sensibilităţii hematiilor şi, respectiv, un titru mai redus în RH.

8. Hematiile • Hematiile de om (grup OI), Rh (-) simplifică procedeul, pentru că nu mai este necesară adsorbţia prealabilă a serurilor pe hematiile care urmează a fi folosite în RIH; • sensibilitatea mai scăzută faţă de anumite virusuri (ex. arbovirusuri) poate fi ameliorată prin tratarea lor cu tripsină.

9. Hematiile • Dificultăţile aprovizionării cu anumite hematii (ex. maimuţă, gâscă sau pui de o zi) au fost depăşite prin introducerea hematiilor stabilizate prin variate procedee (ex. formol, glutaraldehidă) deşi, uneori, acest proces poate determina o afectare a receptorilor hematici; • avantajul lor constă şi în posibilitatea folosirii pentru adsorbţia serurilor care se examinează (îndepărtarea izoaglutininelor).

10. RH • Hemaglutinina (HA) acţionează diferit. • Imaginea hemaglutinării virale este caracteristică: hematiile se aglomerează, formează grunji, care se depun pe fundul godeului (sau eprubetei) sub formă de “umbrelă” în timp ce martorii hematii se depun sub formă de buton sau inel bine delimitat. • De regulă, imaginea aglutinării hematiilor de către virusuri diferă de cea produsă de izoaglutinine (reacţii fals pozitive).

11. Hematiile • Concentraţia hematiilor este unul dintre factorii critici: în concentraţie mică, hematiile sedimentează lent sau deloc iar dacă sunt prea concentrate se depun rapid cu o imagine atipică, greu de interpretat. • In funcţie de sistemul viral şi de provenienţă hematiilor, se recomandă concentraţii adecvate (ex. 0.5% pentru hematii de pasăre sau 0.4% pentru hematii de om).

12. UHA • O unitate hemaglutinantă (UHA) este reprezentată de cea mai mare diluţie de Ag care mai produce o hemaglutinare totală. • Alţi autori afirmă că UHA este dată de diluţia care produce o hemaglutinare de 50% sau citire 2, pentru a reduce erorile date de reacţiile extreme (4, respectiv 1).

13. Citirea RH • In practică, rezultatele hemaglutinării se notează de la 0 la 4: • ++++ = 4 (hemaglutinare 100%); • +++ = 3 (hemeglutinare 75%, sedimentare 25%); • ++ = 2 (hemglutinare 50%, sedimentare 50%); • + = 1 (hemaglutinare 25%, sedimentare 75%); • (-) = 0, reacţie negativă (sedimentare 100%).

14. Reacţia de inhibare a hemaglutinării (RIH) • Mai este denumită reacţia Hirst (1941), după numele celui care a imaginat metoda. • Principiu: Ac inhibitori ai hemaglutinării (IH), specifici imunologic, anulează capacitatea hemaglutinantă a virusului omolog. • Prezenţa IN (inhibitorilornespecifici) impune mai întâi îndepărtarea acestora. • In RIH se utilizează 8 unităţi hemaglutinante. • Ac IH persistă ani de zile atât după infecţii iar secundar vaccinării, un an.

15. RIH • De regulă, hemaglutinarea este împiedicată de către Ac-ii corespunzători Ag-lui hemaglutinant; • în RIH, într-o primă etapă se realizează interacţiunea Ag-Ac (30-90 min.) după care, amestecului i se adaugă suspensia de hematii, rezultatul fiind apreciat după alte 30-90 min.

16. RIH • Spre deosebire de aspectul înregistrat în RH, în RIH în primele godeuri hematiile se depun, pentru ca, odată cu reducerea titrului Ac-lor la diluţiile mari de ser, să apară aglutinarea tipică “în umbrelă”; • martorul Ag hemaglutinant la diluţia de lucru, dă imaginea tipică de umbrelă.

17. RIH - utilizare • pentru evidenţierea Ac-lor care apar ca răspuns la infecţie sau după vaccinare, precum şi Ac-ii formaţi la animalele imunizate în scopul preparării de seruri imune (pentru diagnostic sau terapeutic); • în anumite sisteme virale (ex. arbovirusuri) RIH reprezintă procedeul de preferat pentru identificarea unui izolat viral care manifestă activitate hemaglutinantă.

18. RIH - utilizare • RIH, este poate cea mai răspândită metodă serologică deoarece este simplă, comparativ cu alte metode clasice (RFC, RN) în care standardizarea metodei este uneori mai laborioasă, în pofida unui grad mai redus de specificitate care generează reacţii încrucişate faţă de virusuri înrudite. • RIH este foarte utilă în investigaţii seroepidemio-logice care pot stabili în acest fel prevalenţa anumitor infecţii virale într-o colectivitate, mai ales datorită persistenţei îndelungate a Ac-lor inhibitori ai hemaglutinării.

19. Variabile in RIH • în funcţie de sistemul viral investigat, RIH trebuie să fie efectuată în condiţiile cerute de activitatea hemaglutinantă proprie (diluant şi pH-ul lui, tip de hematii, temperatură); • Atenţie!: de multe ori, SF obţinut plecând de la apă distilată are pH acid 5.5 (dacă SF se obţine utilizând TFS - tampon, fosfat, salin, pH-ul este alcalin, respectiv 7-7.2). Acest aspect trebuie avut în vedere mai ales în diagnosticul gripei.

20. Variabile in RIH • calitatea hematiilor: se folosesc hematii proaspete în interval de 2 săptămâni de la recoltare sau hematii stabilizate; în cazul unor hematii cu o sensibilitate mai redusă se face o eventuală tratare cu tripsină: folosirea hematiilor de om, O I, Rh (-) face inutilă adsorbţia serurile pe hematii;

21. Variabile in RIH • îndepărtarea inhibitorilor nespecifici (IN) din serurile examinate: aceştia realizează - chiar în absenţa Ac specifici hemaglutininei virale blocarea HA, simulând un răspuns umoral pozitiv, deci generând o R fals (+). • De obicei IN fac parte dintre componentele lipoproteice ale serului (componenta beta intervine cel mai frecvent), adesea fiind identificate multiple activităţi faţă de virusuri din aceeaşi familie. • IN se îndepărtează prin tratarea adecvată a serurilor în funcţie de IN care reacţionează în sistemul viral respectiv.

22. Variabile in RIH • In cazul investigării serologice, pe două probe de ser recoltate la un interval adecvat, trebuie să ţinem cont că, în condiţii necorespunzătoare de păstrare a primei probe, Ac hemaglutinino-inhibanţi pe care acesta îi conţine pot fi afectaţi, astfel încât în RIH apare o falsă creştere de titru în a II-a probă de ser, iar rezultatul poate fi sugestiv pentru seroconversie sau pentru dinamica semnificativă.

23. Variabile in RIH • Tratarea serurilor în diferite scopuri afectează uneori rezultatul RIH: • după tratarea cu 2ME pentru distrugerea Ac de tip IgM, în ser pot rămâne urme de reactiv care afectează ulterior Ac hemaglutinanţi obţinându-se rezultate paradoxale (titrul IH creşte, în loc să scadă) ceea ce obligă la verificări prealabile şi eventual la prelucrări pentru îndepărtarea 2ME restant (ex. dializa serului). • Unele metode de îndepărtare a IN realizează şi o scădere a titrului hemaglutinant, mai ales al Ac de tip IgM (ex. tratarea serului cu caolin).

24. Variabile in RIH • Pentru ameliorarea tehnicii a fost propusă varianta acesteia ca micrometodă; • în acest caz, reacţia se simplifică, folosindu-se microplăci şi cantităţi de reactiv, inclusiv de ser, de ordinul microgramelor. • Dezavantajul acesteia este legat de scăderea titrului Ac-lor, deci de posibile rezultate fals negative. • De aceea micrometoda este mai utilă in diagnosti-cul infecţiilor acute şi mai puţin în studiile epide-miologice care se bazează pe evidenţierea Ac anamnestici.