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LEZIONE 8 Ingegneria cellulare

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11 Adriana Maggi. LEZIONE 8 Ingegneria cellulare. Ingegneria Cellulare. Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o integrazione di DNA esogeno.

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LEZIONE 8 Ingegneria cellulare

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Presentation Transcript

  1. CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11 Adriana Maggi LEZIONE 8 Ingegneria cellulare

  2. Ingegneria Cellulare Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o integrazione di DNA esogeno

  3. Finalità dell’ingegneria cellulare applicate alla farmacologia • Identificazione di bersagli di farmaci • Screening di farmaci • Produzione di proteine terapeutiche • Terapia cellulare

  4. Ingegneria cellulare considerazioni preliminari 1. Gene/processo di interesse 2. Tipo di cellula da transfettare 3. Scelta del vettore 4. Modalità di transfezione/infezione 5. Applicazioni

  5. La scelta del sistema cellulare 1. • coltura primaria • cellula immortalizzata • linea tumorale

  6. Scelta del sistema cellulare 2. 1. Facilità di coltura e stabilità 2. Efficienza di transfezione 3. Modificazioni post-traduzionali 4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica 5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)

  7. Scelta del vettore per ingegneria cellulare

  8. 1. La scelta del vettore Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare: 1. iperespressione proteica 2. espressione regolata per studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo 3. studio della regolazione della espressione di un gene

  9. Vettori per ingegneria cellulare • sequenze per la replicazione in procariote • Cassetta di espressione • Polylinker • Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.) • Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione; poliadenilazione; segnali di splicing) • Marcatori di selezione

  10. Promotore virale E.Coli ori Amp resistenza Introne chimerico Promotore T7 pol Polylinker Promotore T3 pol Poliadenilazione Origine di replicazione del fago f1 Poliadenilazione Promotore virale Neo resistenza Vettori di espressione: il vettore pCI-neo

  11. T-antigen e cellule COS. L’uso di cellule COS consente di ottenere alti livelli di espressione di proteine esogene senza l’utilizzo di promotori virali forti. Il gene è clonato in un plasmide che include l’origine di replicazione virale di SV40. Le cellule Cos contengono, nel loro genoma, il gene codificante per il T-antigen, una proteina che riconosce l’origine di replicazione di SV40 e stimola una massiccia replicazione del plasmide.

  12. Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza di E. Coli è possibile regolare l’espressione di un transgene. Il sistema è composto da un transattivatore chimerico che lega tet-responsive-element TRE espresso in modo costitutivo (promotore virale o tessuto-specifico) Il gene la cui trascrizione deve venire regolata è sotto il controllo di un promotore contenente TRE

  13. pCMV tetR VP16 rtetR pCMV VP16 Transcription TRE Gene of interest Pmin CV Il sistema Tet-on/Tet-off E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore di regolazione ed un plasmide contenente il transgene sotto il controllo trascrizionale di un promotore responsivo alla tetraciclina. Plasmidi codificanti per l’elemento di regolazione Tet-OFF Tet-ON Plasmide contenente il transgene

  14. Il sistema Tet-off basato sulla produzione della proteina transattivante tTA è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina

  15. Il sistema Tet-On basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina

  16. Integrazionedi DNA esogenonelgenomacellulare Gene trapping ( integrazionecasuale) Gene targeting (integrazionesito-specifica)

  17. La ricombinazione omologa è il processo alla base della integrazione sito specifica Es. di gene targeting

  18. GENE knock-out; GENE Knock-in Integrazionesito specifica DNA target Gene targeting vector Integrazione random

  19. C9H13N5O4 peso molecolare: 255.23 Ganciclovir, un analogo di nucleosidi che puo’ essere fosforilato ad un tripfosfato analogo da parte dell’enzima timidina cinasi di Herpes simplex e quindi integrato nel DNA.

  20. 5-fosforibosil-1-pirofosfato Uridina monofostato AMINOPTERINA Timidina monofostato Inosina monofostato Guanina monofostato Adenina monofostato Timidina Ipoxantina Timidino chinasi Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio” L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile

  21. 3. Modalità di trasfezione Transfezione transiente o stabile Tecnologia per la transfezione

  22. Transfezioni stabili o transienti Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura. La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate

  23. Transfezione stabile Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione.

  24. ENZIMA FARMACO MECCANISMO Aminoglicoside fosfotransferasi (APH) G418 (Inibitore sintesi proteica) APH inattiva G418 Diidrofolato reduttasi (DHFR) Metotrexate (Inibisce DHFR) Variante resistente DHFR Igromicina fosfotransferasi (HPH) Igromicina B (Inibitore sintesi proteica) HPH inattiva igromicina Adenosina deaminasi (ADA) 9-b-D-furanosil (Xyl-A) (danneggia DNA) Inattiva Xyl-A Xantina-guanina fosforibosil transferasi (XGPRT) Acido micofenolico (Inibisce sintesi GMP) XGPRT sintetizza GMP Timidina chinasi (Tk) Aminopterina (Inibisce sintesi timidina-P) Tk fosforila la timidina Marcatori di selezione per cellule di mammifero

  25. Transfezione stabile - applicazioni Generazione di linee cellulari con caratteristiche specifiche per la produzione di biofarmaci o lo screening di molecole farmacologicamente attive. Servono markers specifici per poter selezionare le cellule transfettate

  26. Transfezione transiente - applicazione Studio della regolazione dell’espressione genica con sistemi reporter Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale Identificazione di molecole attive su enzimi o recettori Studi di correlazione struttura attività di mutanti

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