Microorganismos e Engenharia Genética

1. Universidade Federal de Santa Catarina Disciplina de Microbiologia Geral – MIP7013 Microorganismos e Engenharia Genética Andrea Pellin Jean Paulo Lemos Laryssa de Liz Jenniffer Carolina Silva

2. Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA recombinante Conjunto de processos que permitem a manipulação do genoma de organismos vivos, com a conseqüente alteração das capacidades de cada espécie. Só se tornou possível com a aquisição de novos conhecimentos sobre o código genético.

3. Técnicas de DNA recombinante tiveram início em 1970 Utilização de vetores de clonagem e enzimas de restrição Clonagem Molecular Primeira experiência de clonagem realizada em 1972, por um grupo de pesquisadores chefiados por Paul Berg. Em 1987 surgiu uma nova contribuição, a reação de polimerização em cadeia (PCR)

4. A manipulação genética envolve 5 passos: 1- Obtenção do gene que se pretende transferir; 2- Introdução do gene em um vetor; 3- Transferência e clonagem do gene; 4- Triagem das células modificadas geneticamente; 5- Expressão do gene pelas células modificadas.

5. 1 – Isolamento do gene Extração do ácido nucléico é a primeira etapa. • Para realizar esse isolamento pode-se: • Obter um fragmento de RNA e este transcrever-se em uma cadeia de DNA complementar = ação da transcriptase reversa. • Extrair o DNA, que é então fragmentado pelas enzimas de restrição. Participação das enzimas de restrição é muito importante. Possuem um padrão específico de corte da molécula de DNA. Resulta em fragmentos genômicos que podem ser isolados, clonados e seqüenciados. Tão importante quanto as enzimas de restrição são as ligases, enzimas que possuem a capacidade de ligar covalentemente as extremidades livres dos fragmentos de DNA.

6. 2 – Introdução do gene em um vetor Vetores de clonagem são veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada. A tecnologia do DNArtambém recorre a segmentos de DNA que possuem capacidade de se inserir, casualmente, em outros segmentos de ácido nucléico. Sequências de inserção e Transposons

7. 3 – Transferência e clonagem do gene Consiste na introdução do DNA recombinante (vetor + gene transferido) para uma célula hospedeira adequada. elevada capacidade de multiplicação o que permite a clonagem do DNA recombinante. Célula hospedeira Hospedeiros utilizados podem ser bactérias e leveduras As leveduras apresentam vantagem em relação as bactérias por poderem suportar grandes fragmentos de DNA. A célula hospedeira vai ser escolhida de acordo com o objetivo.

8. Uma célula hospedeira ideal deve ser fácil de manipular e propagar, deve estar disponível , com uma grande quantidade de cadeias geneticamente definidas. Hospedeiros Procarióticos • Vantagem de utilização por serem mais simples; • Escherichiacoli; • Desvantagem: pela falta de membrana nuclear alguns genes eucarióticos não funcionam. Hospedeiros Eucarióticos • Usados quando hospedeiros procarióticos não funcionam; • Suporta grandes fragmentos de DNA. • Saccharomycescerevisae.

9. Fonte: http://www.dbio.uevora.pt/LBM/Foco/Hospedeiros/Hospedeiros.html

10. 4- Triagem das células Nem todas as células hospedeiras captam o vetor recombinado, assim torna-se necessário selecionar as células hospedeiras. Depende da utilização de bancos de DNA. Pode-se também recorrer a bancos de cDNA que contém somente as sequências codificadoras de determinada proteína expressa no tipo de célula que está sendo usada. 5 – Expressão do gene

11. Técnicas de Engenharia Genética • Técnicas dna recombinante a partir de 1970 • Vetores da engenharia genética • PLASMÍDEOS • São células bacterianas que contém pequenas moléculas de DNA circular Estes mantém uma existência independente do cromossomo; no entanto, sua duplicação é sincronizada com a da bactéria, garantindo assim sua transmissão para as bactérias-filhas.

12. VÍRUS • Os vírus, principalmente o bacteriófago são de grande utilidade na Tecnologia do DNA Recombinante. • A região mediana do cromossomo pode ser retirada e substituída por um pedaço de DNA de outro organismo. Sendo assim, quando o cromossomo viral se multiplica, o DNA estranho incorporado à ele também será multiplicado. • Essa técnica é utilizada pelos cientistas para multiplicar um gene.

13. Enzimas de Restrição • A base da técnica do DNA recombinante é a utilização de enzimas de restrição. • Essas enzimas são capazes de cortar uma molécula de DNA em locais bem específicos

14. DNA recombinante O DNA recombinante é uma molécula híbrida obtida pela união de DNSs de fontes biologicamente diferente.

15. Clonagem Molecular • Uma vez preparados os plasmídeos, a tarefa é inseri-los em células bacterianas. Plasmídeos e células bacterianas são postos um em contato com o outro • Alguns plasmídeos de bactérias carregam naturalmente genes que lhes conferem resistência a certo antibiótico. Os pesquisadores escolhem para DNA recombinante, plasmídeos que já têm o gene para resistência ao antibiótico. • Essas bactérias se reproduzem e todo o clone resultante possuirá o plasmídeo com o gene novo. • Já é possível introduzir genes humanos que codificam insulina e hormônio de crescimento em bactérias, as quais passam a fabricar essas substâncias.

16. PCR – Reação de Polimerização em Cadeia Surgiu em 1987 • Estatécnicapermiteamplificardeterminado locus, quando se tem poucaquantidade de DNA genômico. • Polimeraseextraídadabactéria • Thermusaquaticus

17. Aplicações da Engenharia Genética • Biorremediação; • Produção de substâncias úteis aos sereshumanos; • Vacinas; • Terapia gênica; • Bactérias que produzem toxinas contra parasitas; • Organismos geneticamente modificados.

18. Biorremediação Inserção de genes que codificam enzimas catabólicas específicas para a molécula-alvo; Incorporação por plasmídios ou transposons; Genes instáveis Pseudomonas

19. Produção de Substâncias Úteis Fonte: http://www.iisc.ernet.in/currsci/aug252005/614.pdf

20. Produção de Substâncias Úteis Fonte: Recombinant DNA, 2d ed. ScientificAmerican Books

21. Vacinas Fonte: http://scielo.iec.pa.gov.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2176-62232011000200008&lng=pt

22. Terapia Gênica Fonte: http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=2010_Lecture_22

23. Bactérias que produzem toxinas contra parasitas

24. Organismos Geneticamente Modificados

25. Biobalística

26. Agrobactérias

27. Regulamentação • Em 05 de janeiro de 1995 foi criada no Brasil a lei 8974, Normas para o Uso das Técnicas de Engenharia Genética e Liberação no Meio Ambiente de Organismos Geneticamente Modificados. • Em 1998 pela primeira vez que a MONSANTO conseguiu a aprovação para sua soja RoundupReady a qual foi autorizada pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio). Após essa aprovação, o Greenpeace e o Instituto de Defesa do Consumidor (IDEC) entraram com um processo na 6ª Vara de Justiça Federal contra a Monsanto e o governo. Esse processo marcou o inicio da moratória judicial para liberações comerciais de transgênicos no Brasil e fez com que as variedades transgênicas permanecessem fora do mercado entre 1998 e 2003. • Em 28 de janeiro de 2000 foi assinado o Tratado de Cartagena, é o único tratado internacional que trata do movimento transfonteiriço de transgênicos.

28. LEI Nº 11.105, DE 24 DE MARÇO DE 2005 Regulamenta os incisos II, IV e V do § 1odo art. 225 da Constituição Federal, estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização de atividades que envolvam organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados, cria o Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS, reestrutura a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança – CTNBio, dispõe sobre a Política Nacional de Biossegurança – PNB, revoga a Lei no8.974, de 5 de janeiro de 1995, e a Medida Provisória no2.191-9, de 23 de agosto de 2001, e os arts. 5o, 6o, 7o, 8o, 9o, 10 e 16 da Lei no10.814, de 15 de dezembro de 2003, e dá outras providências.

29. Conselho Nacional de Biossegurança - CNBS Membro Efetivo do Colegiado - Ministro de Estado - Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior - Gabinete do Ministro Composição Finalidade Fixar princípios e diretrizes para a ação administrativa dos órgãos e entidades federais com competências sobre a matéria; Analisar, a pedido da CTNBio, quanto aos aspectos da conveniência e oportunidade socioeconômicas e do interesse nacional, os pedidos de liberação para uso comercial de OGM e seus derivados; Avocar e decidir, em última e definitiva instância, com base em manifestação da CTNBio e, quando julgar necessário, dos órgãos e entidades referidos no art. 16 desta Lei, no âmbito de suas competências, sobre os processos relativos a atividades que envolvam o uso comercial de OGM e seus derivados.

30. Comissão Técnica Nacional de Biossegurança - CTNBio A CTNBio, integrante do Ministério da Ciência e Tecnologia, é instância colegiada multidisciplinar de caráter consultivo e deliberativo, para prestar apoio técnico e de assessoramento ao Governo Federal na formulação, atualização e implementação da PNB de OGM e seus derivados, bem como no estabelecimento de normas técnicas de segurança e de pareceres técnicos referentes à autorização para atividades que envolvam pesquisa e uso comercial de OGM e seus derivados, com base na avaliação de seu risco zoofitossanitário, à saúde humana e ao meio ambiente.

31. http://www.ctnbio.gov.br/

32. Referências Bibliográficas: CANDEIAS, J.A.N. A engenharia genética. Saúde Pública, São Paulo, 25: 3-10,1991. PENIDO, G.C.E. O início da genética de microrganismos no Brasil. In: REUNIÃO ANUAL DE GENÉTICA DE MICRORGANISMOS, 18., São Paulo, 1992. Programa e Resumos. São Paulo, USP; SBG, p. 25, set. 1992. http://www.libertaria.pro.br/tdna_recombinante_intro.html http://www.songazetehaberleri.com/thermus-aquaticus-bakterisi- ozellikleri.html/thermus-aquaticus-bakterisi-ozellikleri-onemi-nedir http://www.notapositiva.com/pt/trbestbs/biologia/12_o_rastreio_dos_transg_e_o_codigo_de_vida_d.htm