Bactérias degradadoras de 2,4-D (dicloro fenoxiácido acético)

1. Bactérias degradadoras de 2,4-D (dicloro fenoxiácido acético) MICROBIOLOGIA Alunos: Cristiene Miranda Deise Mariana Paloma Veloso

2. 2,4-D(ácido diclorofenoxiacético) O 2,4-D nome simplificado do ácido diclorofenoxiacético, é um dos herbicidas mais comuns e antigos do mundo. Foi desenvolvido na década de 40 como parte do esforço de um grupo de cientistas. Em 1941, verificou-se que o 2,4-D tinha potencial para afetar os processos de crescimento em plantas de um modo semelhante aos reguladores de crescimento naturais de planta, razão pela qual o produto foi descrito depois como “hormonal”. Hoje, o 2,4-D e outros produtos da mesma família química,conhecidos como fenoxiacéticos, estão sendo usados mundialmente como ferramenta básica na agricultura moderna. A razão para esse sucesso não é só devido a sua grande atividade como herbicida, mas também devido a um dos melhores perfis toxicológicos disponíveis e um preço muito acessível.

3. O uso do 2,4-D vem crescendo desde a sua introdução no mercado; no início, devido as suas vantagens como herbicida seletivo de baixo custo e ultimamente com a adoção do desenvolvimento da prática do plantio direto (que iniciou o conceito de agricultura ambientalmente sustentável) como uma ferramenta insubstituível para controle de plantas daninhas Os herbicidas do grupo fenoxiacético são provavelmente os herbicidas mais utilizados. Estados Unidos, Europa e antiga União Soviética são os maiores mercados de 2,4-D. O trigo produzido nos Estados Unidos utiliza praticamente só o 2,4-D e há previsão de que o consumo global deverá crescer na próxima década. No Estados Unidos, onde o 2,4-D é o terceiro produto fitossanitário mais utilizado, mais de 31.000 toneladas são usadas anualmente. No reino Unido, é um dos seis mais utilizados.

4. O composto controla essencialmente as ervas daninhas de folhas largas, como por exemplo, corda-de-viola ou corriola, leiteira ou amendoim-bravo, guanxuma, poaia, serralha, erva-quente, entre outras. Temos também a trapoeraba, erva daninha de difícil controle. O 2,4-D só pode ser utilizado em culturas para quais ele foi registrado. No Brasil, as culturas são: soja (em pré-plantio), milho, cana-de-açúcar, café, trigo, aveia, centeio, arroz e pastagem formada. só pode ser utilizado em áreas rurais. O produto não tem registro e portanto não pode ser recomendado para utilização em áreas urbanas. No Brasil a substancia é mais utilizada na cultura da soja, aplicado para dessecação das ervas daninhas antes do plantio da cultura propriamente dita.Deve ser obedecido o intervalo de 7 a 10 dias da aplicação do 2,4 D e posterior plantio da cultura de soja

5. Apesar do composto ser antigo ele é muito utilizado na atualidade porque possui um amplo espectro de controle de ervas daninhas e apresenta ótima relação custo-benefício quando comparado com outras opções de mercado. É uma ótima opção para manejo de plantas daninhas resistentes a inibidores de ALS (leiteira, picão-preto e nabiça) na dessecação e em pós emergência da cultura do trigo Os principais produtos que possuem o composto 2,4 D em suas formulações registrados no Brasil são: U-46 Fluid (Agripec), AMINOL 806(Milenia), DMA 806 (Dow Agrosciences).As formulações do composto que existem no mercado brasileiro são: éster e amina, porem o único a ser comercializado no Brasil é a formulação amina. O Ministério da Saúde, através da Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), são quem define a classe toxologica no país O 2,4 D de formulaçao amina é considerado classe 1 por causar irritação ocular

6. Comparação de DL 50 (mede o efeito de uma exposição ao produto durante um curto período de tempo) do 2,4 D com outros produtos Substância Química DL 50 mg i.a/ Kg P.V. 2,4-D ácido 639 Álcool etílico (bebidas alcoólicas) 10.000 Cloreto de sódio (sal de cozinha) 4.000 Aspirina (remédio) 1.000 Nicotina (cigarro) 1 Toxina butolínica (contaminante alimentar) 0,00001

7. De acordo com os estudos de dissipação do ácido, sal e éster, a meia-vida média do 2,4-D no solo varia de 4 a 10 dias. Isso significa que, se aplicarmos 1 litro/ha de 2,4-D sobre uma determinada área, a cada 4-10 dias teremos a metade dessa quantidade, ou seja, 0,5 litro/ha. Passados mais 4-10 dias, teremos 0,25 litro/ha, e assim por diante até a completa degradação. O 2,4-D é degradado principalmente por microrganismos do solo. Quanto maior a atividade microbiana no solo, mais rapidamente o 2,4-D será degradado. A taxa de degradação aumentará com o aumento do pH, teor de matéria orgânica e da temperatura. Na água a degradação pode variar de 1-28 dias, dependendo do nível de oxigênio presente. Quanto mais oxigênio houver, mais rapidamente o 2,4-D será degradado.

8. A legislação brasileira em relação aos “padrões de potabilidade” de água, no que se refere ao 2,4-D estabeleceu uma Portaria 1469/00 do Ministério da Saúde preconiza que o limite máximo de 2,4-D em água potável seja de 30μg/L igual ao que recomenda a OMS( Organização Mundial da Saúde).

9. Fórmula estrutural: Fórmula bruta: C8H6Cl2O3

10. Grupo químico: fenoxiacéticos (Ácido ariloxialcanóico).  • Nome químico: éster ou sal amina do ácido 2,4-diclorofenoxiacético.  • Absorção: é absorvido pelas folhas, raiz e caule.  • Classe: Herbicida • Classificação toxicológica: Classe I • Uso agrícola: autorizado conforme indicado • Translocação: apossimplástica – neste caso, as moléculas difundem-se na cutícula, movimentam-se pelos espaços intercelulares e penetram no • floema, seguindo o curso dos nutrientes. 

11. Modalidade de emprego: aplicação em pré e pós-emergência das plantas infestantes nas culturas de arroz, aveia, café, cana-de-açúcar, centeio, cevada, milho, pastagens, soja, sorgo e trigo. Culturas Modalidade de emprego Intervalo de Segurança LMR (mg/kg) Arroz Pré/Pós-emergência 0,2 (1) Aveia Pré/Pós-emergência 0,2 (1) Café Pré/Pós-emergência 0,1 30 dias Cana-de-açúcar Pré/Pós-emergência 0,1 (3) Centeio Pré/Pós-emergência 0,2 (1) Cevada Pré/Pós-emergência 0,2 (1) Milho Pré/Pós-emergência 0,2 (2) Pastagens Pré/Pós-emergência 300,0 (5) Soja Pré/Pós-emergência 0,1 (4) Sorgo Pré/Pós-emergência 0,2 (1) Trigo Pré/Pós-emergência 0,2 (1)

12. Produtos de origem animal (*) LMR (mg/kg) Carne 0,05 Leite e produtos lácteos 0,05 Ovos 0,05 (1) Intervalo de segurança não determinado por ser de uso até a fase de emborrachamento. (2) Intervalo de segurança não determinado por ser de uso desde a fase pré-emergência até o milho atingir a altura de 25 cm. (3) Intervalo de segurança não determinado por ser de uso em pré e pós-emergência até 3 (três) meses após o plantio ou corte. (4) Uso permitido somente em pré-plantio. (5) Intervalo de segurança não determinado. (*) Intervalo de segurança não determinado por tratar-se de resíduo estranho. l) Ingestão Diária Aceitável (IDA) = 0,01 mg/kg p.c. m) Contaminante(s) de importância toxicológica para o Ingrediente Ativo e seu limite máximo: Dioxinas totais = 0,01 ppm

13. Muitas atividades dos vegetais são comandadas pela ação de hormônios ou fitormônios, que determinam o crescimento e o desenvolvimento dos vegetais. O composto 2,4 D é considerado uma auxina de efeito herbicida. As auxinas são produzidas no ápice do vegetal, sendo distribuídas por um transporte polarizado do ápice para o resto do corpo do vegetal. Um dos efeitos das auxinas está relacionado com o crescimento, pois atuam sobre a parede celular, provocando sua elongação ou distensão e, conseqüentemente, o crescimento do vegetal. Na verdade os efeitos das auxinas sobre os vegetais é muito diversificado, dependendo do local de atuação e concentração, podem apresentar efeitos completamente antagônicos.

14. Experimento de Went em 1928 a cerca das auxinas Went trabalhou com coleóptiles de gramíneas, blocos de ágar, observando o comportamento do crescimento do vegetal após a retirada do ápice do mesmo. cortou o ápice do coleóptile, colocando-o em contato com um bloco de ágar. Depois de certo tempo, o bloco de ágar era colocado sobre o coleóptile decapitado. O resultado obtido com este procedimento foi o mesmo que seria obtido se o ápice do coleóptile estivesse presente no vegetal. Quando o bloco de ágar, que estivera em contato com o ápice do coleóptile, era colocado de modo a cobrir apenas metade da extremidade do ápice do vegetal, verificava-se um crescimento maior do lado em contato com o bloco de ágar, resultando numa curvatura do coleóptile no sentido contrário da posição do bloco de ágar.

17. O efeito herbicida é dado por uma auxina sintética como é o caso do composto 2,4 D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético). Em altas concentrações esta auxina é tóxica para plantas de folhas largas (dicotiledôneas), em áreas de campo ou de agricultura intensiva , eliminando as plantas chamadas de ervas daninhas nestas áreas. O 2,4 - D aplicado sobre uma planta de picão (Bidens pilosus) e uma gramínea (Poa annua) age seletivamente, matando apenas o exemplar da primeira espécie.

18. Marcas comerciais, formulações e fabricantes Do produto * Marca registrada de Dow Agrosciences Ind. Ltda .  [EMBRAPA]

19. De misturas com 2,4-D * Marca registrada de Dow Agrosciences Ind. Ltda. 

20. Nas ervas daninhas o herbicida 2,4 D provoca: • bloqueio na germinação das sementes e/ou estabelecimento de mudas; • impedem a produção de carboidratos essenciais, proteínas ou lipídios (óleos e gorduras) pelas plantas; • desidratam folhas e caules. • efeitos hormonais no crescimento e desenvolvimento das plantas • caules torcidos e folhas de enroladas em poucas horas, amarelecimento, coloração marrom • afeta a divisão celular, por exemplo, interrompendo o mecanismo pelo qual os cromossomos se dispõem em uma célula, que se prepara para dividir em duas.

21. O Diagrama 1 mostra uma enzima funcionando normalmente. No Diagrama 2, o herbicida 2,4 D está bloqueando a união das substâncias bioquímicas para a formação do produto normal. Como resultado, a planta é privada do produto, e componentes potencialmente prejudiciais da estrutura se acumulam. O Diagrama 3 mostra uma enzima que sofreu uma mutação que faz com que a reação possa continuar, mesmo na presença do herbicida. Neste caso o herbicida é seletivo para as espécies com este tipo de enzima

22. Atividade microbiana em solo cultivado com cana-de-açúcar após aplicação de herbicidas

25. Nos tratamentos solo não-rizosférico e solo rizosférico sem herbicida, observou-se decréscimo do qCO2 até os 30 DAA e, posteriormente, sua estabilização. Constatação semelhante foi feita em solos rizosféricos com 2,4-D, provavelmente pelo fato de este herbicida não estar mais afetando TR, em razão da sua degradação no solo. A dissipação do 2,4-D em solos de clima tropical é relativamente rápida, apresentando meia-vida de quatro semanas . Conclui-se que o de maneira geral para este experimento o 2,4-D foi um dos herbicidas que menos prejudiciais à microbiota do solo. Estudos realizados por Sandman & Loos (1984) encontraram taxas mais elevadas de microorganismos degradadores de 2,4 D em solos da rizosfera de a cana-de-açucar do que em solos não rezosféricos. Os autores explicam que os degradadores de 2,4 D parecem ter sido seletivamente favorecidos na rizosfera da cana-se-açucar

26. Um diagnostico rápido para identificar biodegradadores é observar a mudança de cor do meio de cultura, ou talo de degradação ao redor das colônias, em função do uso de indicadores acido-base. A viragem é causada por um processo metabólico especifico de linhagens degradadores. Um exemplo é apresentado com o uso do herbicida atrazim onde usa-se o indicador vermelho de bromocresol em um meio de sais minerais com 2,4 D como única fonte de carbono e extrato de levedura como fator de crescimento. A oxidação microbiana do 2,4 D resulta na produção de HCl, que muda a cor do meio de vermelho (PH 7) para amarelo (PH 5,2). Desse modo, esse e outros indicadores acido-base, incorporados ao meio de cultura, podem ser usados para isolamento de microorganismos degradadores de pesticidas organoclorados.

27. Os herbicidas quando expostos ao meio ambientes sofrem degradações química,físicas e biológicas. Sendo que a biodegradação é a principal via de degradação de muitos herbicidas no meio ambiente. • Existe uma grande variedade de microorganismos capazes de degradar herbicidas, a biodegradação pode ser: • Culturas puras • Culturas mistas • Microflora dos solos

28. A biodegradação de ácidos fenoxiácetico por bactérias ocorre por dois caminhos de acordo com os compostos intermediários: • Via fenol correspondente, na qual o 2,4-D sofre inicialmente a perda da cadeia alquilíca por meio da clivagem oxidativa ocasionada pela enzima 2,4-D mono oxigenase dando origem ao 2,4-diclorofenol . Este é orto hidroxilado pela 2,4 diclorofenol hidrolase gerando o 3,5diclorocaterol. O cartecol sofre a clivagem orto do anel aromático dando origem ao ácido 2,4dicloromucônico por meio do catecol 1,2dioxigenase. Outras reações como lactonização e deslactonização, vão ocorrendo e gerandoos demais metabólitos • Via ácido hidroxifenoxiacético, no qual o 2,4 –D é didroxilado originando o ácido 2,4-diclo-6-hidroxifenoxiacético. Este por clivagem da ligação éter perde a cadeia alcanóica gerando o 3,5diclorocartecol. A partir da geração desde metabóito as duas vias degradativa passam a gerar os mesmo metabólitos

29. Bactérias degradadoras de 2,4 D • Alcaligenes eutrophus (JMP 134) • Arthrobacter sp • Pseudomonas cepacia (AC 1100) • P. putida • P. chrysosporium

30. Arthrobacter. Note the variation the in shapes of the organisms. From the Virginia Polytechnic Institute and State University.Forma de bacilo, gram negativa

31. Pseudomonas cepacia Kingdom : BacteriaPhylum : ProteobacteriaClass : Beta ProteobacteriaOrder : BurkholderialesFamily : Burkholderiaceaethis is badGenus : BurkholderiaSpecies : B. cepacia complex

32. P. putida

35. Os resultados obtidos na biodegradação de 2,4 D livre por P.putida, demonstra que esta bactéria pode degradar maiores percentagens do composto, sem que o 2,4 D se torne tóxica a ela.

40. Os fungo utilizado na degradação do 2,4-D são • Aspergillus niger • Alcaligeneges eutrophus • Arthobacter sp

41. Referencias bibliográficas • Barros, R. T. V.; Chernicharo, C. A. L.; Héller, L.; Von Sperling, M.; Manual de Saneamento e Proteção Ambiental para os Municípios, Saneamento DESA-UFMG 1996, vol. 2, cap. 5.         • Andreozzi, R.; Caprio, V.; Insola, A.; Marotta, R.; Catal. Today1999, 53, 51.         • Bertazzoli, R.; Pelegrini, R.; Quim. Nova 2002, 25, 477.          • Nogueira, R. F. P.; Jardim, W. F.; Quim. Nova 1998, 21, 69.         • Ziolli, R. L.; Jardim, W. F.; Quim. Nova 1998, 21, 319.          • Tryk, D. A.; Fujishima, A.; Honda, K.; Electrochim. Acta 2000, 45, 2363.         • Watts, R. J.; Kong, S.; Orr, M. P.; Miller, G. C.; Henry, B. E.; Water Res. 1995, 29, 95.          • Melián, J. A. H.; Rodríguez, J. M. D.; Suárez, A. V.; Rendón, E. T.; Campo, C. V.; Arana, J.; Penã, J. P.; Chemosphere 2000, 41, 323.         • Otaki, M.; Hirata, T.; Ohgaki, S.; Water Sci. Technol.2000, 42, 103.       • Dunlop, P. S. M.; Byrne, J. A.; Manga, N.; Eggins, B. R.; J. Photochem. Photobiol., A2002, 148, 355.         • Kondo, M. M.; Orlanda, J. F. F.; Ferreira, M. G. A. B.; Grassi, M. T.; Quim. Nova2003, 26, 133.