UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

1. UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE CEPAS DE RIZOBIOS ASOCIADOS A CULTIVOS DE ARVEJA (Pisum sativum L.), CHOCHO (Lupinus mutabilis S.), FRÉJOL (Phaseolus vulgaris L.), HABA (Vicia faba L.) Y VICIA (Vicia sp.) EN SUELOS DE LA PROVINCIA DE IMBABURA Y OBTENCIÓN DE UN BANCO DE CEPAS. PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO O TÍTULO DE: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA María José Carpio Espinosa Febrero, 2014

2. PROYECTO PIC 12 INIAP 009 código: 2153902800021703 “Manejo adecuado de abonos verdes y microorganismos fijadores de nitrógeno dentro de sistemas de producción agroecológicos” Soraya Alvarado, Ph.D

3. INTRODUCCIÓN Fertilizantes nitrogenados Uso de rizobios

4. Inoculación exitosa: identificación y selección de cepas Último estudio rizobios 2004 Cepas foráneas

5. Caracterización fenotípica rizobios Preservación bacteriana Arveja = 185 kg N/ha Chocho = 400-900 kg N/ha. Haba = 150-500 kg N/ha. Fréjol = 60 kg N/ha Vicia = 125-300 kg N/ha. Evaluación de FBN en invernadero y campo Producción inoculantes a nivel nacional

6. OBJETIVOS Recolectar cepas de rizobios a partir de nódulos de arveja, chocho, fréjol, haba y vicia en suelos de Imbabura. Caracterizar morfológica y bioquímicamente las cepas de rizobios. Formar un cepario de rizobios a partir de las cepas de INIAP y las recolectadas.

7. MATERIALES Y MÉTODOS Recolección de nódulos A. Selección de mejor planta en floración B. Excavación de raíces y verificación del color del nódulo C. Nódulos en tubos con sílica-gel

8. Desinfección de nódulos A. Hidratación de nódulos en agua estéril A. Nódulos en etanol (95%) e hipoclorito (3%) C. Lavado de nódulos en agua estéril.

9. Aislamiento de rizobios recolectados de Imbabura A. Aislamiento a partir de nódulos B. Purificación por agotamiento C. Multiplicación

10. MATERIALES Y MÉTODOS Reactivación de rizobios banco INIAP A. Cepa liofilizada B. Siembra de cepa con solución peptona 0,1% C. Crecimiento bacteriano D. Purificación por agotamiento Cepas medio LMA refrescamiento Nistatina + PCNB

11. Pruebas de autentificación LMA + PBC (café) LMA + ABT (verde) LLA + RB (blanco) GPA + PBC (púrpura) Tinción de Gram Liofilización A. Peptona(10%)+ sacarosa(20%) B. Tubos eppendorf con solución y cepa C. Liofilización de cepas

12. Caracterización morfológica (Prescott, 2004)

13. Caracterización bioquímica C. Relación McF [4] y suspensión 109 cel/mL A. Escala de McFarland B. Suspenciones bacterianas 109 cel/mL 105 cel/mL Dilución agua estéril

14. PRUEBAS BIQUÍMICAS - Fuentes de carbono - Fuentes de nitrógeno - Metales pesados - Antibióticos - Urea - NaCl - pH

15. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Áreas de muestreo Nódulos de arveja, fréjol, haba y vicia Nódulos chocho Sherman et al. (1991)

16. Aislamiento de rizobios 105 cepas rizobios Imbabura Diecinueve no viables Grisales y Fuentes (2005), CIAT (1988). Dieciséis cepas INIAP Dos cepas colonias rojas Kuykendallet al. (2005) Todos los rizobios Crecimiento rápido 3 días cepa “C8 B” Crecimiento lento 7 días

17. Pruebas de autentificación Rhizobium etli A. GPA+PBC: no cambio de color B. LLA+RB: no cambio de color C. LMA+PBC: reacción ácida D. LMA+ABT: Reacción ácida Bradyrhizobium A. GPA+PBC: no cambio de color B. LLA+RB: no cambio de color C. LMA+PBC: reacción alcalina D. LMA+ABT: Reacción alcalina

18. Rhizobium leguminosarum A. GPA+PBC: no cambio de color B. LLA+RB: Cambio parcial de color C. LMA+PBC: reacción ácida D. LMA+ABT: Reacción ácida Medio GPA+PBC Tres cepas : TAL 1236 FB 481 FR 1063 Norris (1965): cepas suelos alcalinos A. Acidifica el medio a los dos días B. Retorno parcial de color a los tres días C. Retorno total de color a los cinco días

19. Agrobacterium A. GPA+PBC: cambio de color B. LLA+RB: Cambio de color C. LMA+PBC: Reacción ácida D. LMA+ABT: Reacción ácida Dos cepas : R-FR-PE-2b / R-HA-PE-3 Bacilos Gram - Tinción de Gram A. R. tropici B. R. etli C. R. leguminosarum Se autentificaron100 cepas como rizobios

20. Caracterización morfológica Rizobios de arveja, fréjol, haba y vicia: opaca translúcida elástica acuosa rosado coral rosado pálido Rhizobium etli Abundante goma Rhizobium tropici Sin goma Crecimiento rápido Mediano (2-5 mm) convexa entero circular Kuykendall et al. (2005), CIAT (1988)

21. Rizobios de chocho: gomosa elástica Crecimiento lento Crecimiento rápido Pequeño (1 mm) Mediano (2-3 mm) Ochrobactrum Bradyrhizobium Rosado coral Abundante goma pulvinada opaca Martínez (2007): Bradyrhizobium Trujillo et al. (2005): Ochrobactrum,

22. ARVEJA: 7 grupos CS: 0.86

23. CHOCHO: 6 grupos CS: 0.86 FRÉJOL: 6 grupos CS: 0.88

24. HABA: 5 grupos CS: 0.89 VICIA: 4 grupos CS: 0.86

25. Caracterización bioquímica Mayoría de cepas sensibles: - pH 4.5 y 8.5 - NaCl 1% y 2% - zinc - kanamicina y cloranfenicol - citrato y glicina (Romero, 2009) Rizobios tolerantes a condiciones hostiles Cepas INIAP y chocho R-CH-MO-78b Cepa muy resistente Fuentes carbono A. xylosa B. fructosa C. glucosa D. galactosa E. maltosa F. sacarosa G. dulcitol H. eritritol I. tartrato J. lactato K. sorbosa M. citrato

26. Fuentes nitrógeno A. triptófano B. tirosina C. glicina Antibióticos A. ácido nalidíxico B. cloranfenicol C. kanamicina D. estreptomicina Metales pesados A. zinc B. plomo C. cobre D. aluminio Urea A. 20 ppm C. 100 ppm B. 50 ppm D. 500 ppm

27. pH A. 4.5 B. 5 C. 8.5 NaCl A. 0.5% B. 1% (NC) C. 2% (NC) No resistente Odee et al. (1997) y Cuadrado et al. (2009), Shamseldin & Werner (2005), Matos et al. (2001) Cepa “C8 B” Bradyrhizobium Diversidad genética rizobios Contreras et al. (2007), Cuadrado et al. (2009), Marquina et al. (2011), Martínez (2003) Resultados en laboratorio Matos y Zuñiga (2002)

28. ARVEJA: 11 grupos CS: 0.89

29. CHOCHO: 6 grupos CS: 0.89 FRÉJOL: 13 grupos CS: 0.86

30. HABA: 11 grupos CS: 0.89 VICIA: 8 grupos CS: 0.92

31. CEPAS DE ARVEJA FRÉJOL HABA VICIA mediana y abundante nodulación en raíz secundaria morfología característica crecimiento rápido productoras de ácido Capacidad resistencia condiciones de estrés Rhizobium CEPAS DE CHOCHO morfología característica escasa nodulación en raíz primaria productoras de ácido crecimiento rápido Ochrobactrum Gran capacidad resistencia condiciones de estrés CEPA “C8B” DE CHOCHO crecimiento lento Baja capacidad adaptación condiciones de estrés productora de alcalinidad Bradyrhizobium morfología característica

32. CONCLUSIONES Las cepas de rizobios de fréjol, arveja, haba y vicia pertenecen al género Rhizobium. Las cepas de rizobios de chocho pertenecen al género Ochrobactrum. La cepa C8 B, del banco del INIAP, pertenece al género Bradyrhizobium. Catorce cepas de rizobios fueron las más resistentes a condiciones de estrés y fuentes nutricionales. Las pruebas bioquímicas sirven para esbozar la diversidad genética de los rizobios y su papel ecológico. Existe una alta diversidad morfológica y bioquímica de los rizobios aislados de suelos de Imbabura. El banco germoplásmico de rizobios servirá como una colección de referencia para futuras investigaciones.

33. RECOMENDACIONES Caracterizar molecularmente las cepas. Estudiar los suelos de las localidades donde se recolectaron los nódulos. Evaluar a nivel de invernadero y campo la fijación de nitrógeno de las cepas.

34. RECOMENDACIONES Desarrollar pruebas de biofertilización con rizobios más resistentes. Recolectar nódulos en otras regiones del país. Sincronizar la fecha de recolección con la época de floración.

35. AGRADECIMIENTOS A la ESPE, Departamento de Ciencias de la Vida, Facultad de Ingeniería en Biotecnología, por mi formación académica profesional. Al INIAP, DMSA, por haberme permitido la ejecución e instrumentación para realizar este trabajo. A la SENESCYT por haber financiado este proyecto.

36. GRACIAS