Introdução a Enzimologia e Processos fermentativos

1. Msc J.Gabriel Roderjan Introdução a EnzimologiaeProcessos fermentativos Aula 1 e 2 – Farmácia 8ºP 2009

2. Plano de Trabalho PROGRAMA TEÓRICO: • Plano de trabalho Apresentação da bibliografia; sorteio dos seminários • Introdução e Histórico; catálise; atividade enzimática; cinética enzimática; • Aplicação clínica das enzimas; • Microrganismos e Enzimas de importância aos processos fermentativos • Obtenção de enzimas e produtos de digestão enzimática • Introdução aos processos fermentativos • Seminários: Fermentação alcoólica: Aguardentes e outras bebidas • Seminários: Fermentação acética: vinagres • Seminários: Fermentação alcoólica: cervejas e vinhos • Seminários: Fermentação láctica: vegetais • Seminários: Fermentação láctica: leite e derivados • Seminários: Fermentação láctica: pescados e ensilados • Seminários: Processos biotecnológicos

3. Aula teórica • Apresentação dos tópicos • Leitura de bibliografia • Discussão dos tópicos • Perguntas

4. Plano de Trabalho PROGRAMA PRÁTICO: • Plano de trabalho de aulas práticas; Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos • Obtenção, caracterização e quantificação de enzimas; Biorreatores e transferência de oxigenio em biorreatores • Imobilização de enzimas • Purificação de enzimas • Preparação para fermentação láctica do leite • Fermentação láctica: leite • Preparação para produção de cerveja • Fermentação alcoólica: cervejas

5. Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos • Tutorial • Formulação de protocolos de procedimento; • Formulação do plano de ação; • Check-list; • Documentação e legislação • Procedimento operacional padrão • Resultados e modificações

6. AVALIAÇÕES AULAS PRÁTICAS • Avaliação de desempenho nas aulas práticas • Trabalhos em sala de aula • Valor 2,0 PROVAS • 1ª prova 1° bimestre - 09/09/2009 - valor 8,0 • 2ª prova 1°bimestre - 07/10/2009 - valor 8,0 • 3ª prova 2°bimestre - 04/11/2009 - valor 5,0 • 4ª avaliação - relatório aulas práticas 2°bimestre - 02/12/2009 - valor 10,0 • Provas de 10 à 15 questões, com 1 à 3 questões discursivas SEMINÁRIOS • Trabalho impresso • Apresentação • Valor 5,0

7. Bibliografia LEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger princípios de bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006. xxviii, 1202 p. ISBN 85-7378-166-1 (enc.) ALBERTS, Bruce. Fundamentos da biologia celular. Porto Alegre: ArTmed, 2006. 1 v. (várias paginações) ISBN 78-85-363-0679-7 BRUCHMANN, Ernest-Erich. Bioquímica técnica: Ernst-Erich Bruchmann ; traducido por Aurora Perez Torrome. Zaragosa: Acribia, 1980. 233 p. ISBN 84-200-0437-5 LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio; BORZANI, Walter. Tecnologia das fermentações. São Paulo: E. Blücher, c1975. 285 p. AQUARONE, Eugênio; LIMA, Urgel de Almeida; BORZANI, Walter. Alimentos e bebidas produzidos por fermentação. São Paulo: E. Blücher, 1983. 227 p. (Biotecnologia ; v. 5) CARVALHO, Geraldo Camargo de. Aulas de quimica. São Paulo: Nobel, 1979.v.1 CRUEGER, Wulf; CRUEGER, Anneliese. Biotecnología: manual de microbiología industrial. Zaragosa: Acribia, 1993. 413 p. ISBN 84-200-0743-9 BORZANI, Walter; LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio. Engenharia bioquímica. São Paulo: E. Blücher, 1975. 300 p. (Biotecnologia ; v. 3) AMORIM, Henrique Vianna de; LEÃO, Regina Machado. Fermentação alcoólica: ciência e tecnologia. Piracicaba: Fermentec, 2005. xv, 434 p. ISBN 85-99011-01-04 (enc.) WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de los enzimas. Zaragosa: Acribia, 1991. 444 p. ISBN 84-200-0705-6 http://www.bireme.br/php/index.php www.anvisa.gov.br/ www.fda.gov www.biotecnologia.com.br/ www.atcc.org/ www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme

8. Modelo de relatório de seminário SUMÁRIO • Introdução • Aplicação • Método (como se utiliza e quais vias bioquímicas envolvidas) • Organograma (seqüência de eventos) • Legislação e Controle de qualidade • Referências • Anexos

9. Aspectos gerais

10. Vida= fn(matéria x energia) • Fn é a transformação de partículas, átomos e moléculas; • Reações químicas • Estabilidade • Conversão da matéria em energia e da energia em matéria • Fonte principal: Sol • Meio: água

11. Reações químicas • A + B ↔ AB • AOH + HB ↔ AB +H2O Relação entre a constante de equilíbrio e a variação de energia livre de uma reação S P Reação: Keq = [P]/[S] DG = - RT ln Keq Reações com DG’ grande e negativo significa que o equilíbrio é favorável à formação dos produtos

12. S P Reação = colisão de moléculas em uma determinada orientação com uma quantidade definida de energia denominada ΔG (energia de ativação do estado de transição ou energia livre de ativação)

13. Facilitadores de reação • Catálise = alteração na velocidade da reação William P. Jencks, article in Advances in Enzymology, 1975 • Redução na energia de ativação (ΔG); • Sem um catalisador : A + B ↔ AB em 20 minutos e X de ΔG • Com um catalisador : A + B ↔ AB em 20 milésimos de segundo e X/5 de ΔG

14. Tabela da relação entre constante de equilíbrio e energia livre de ativação ΔG

15. A velocidade de uma reação e a energia de ativação A lei de velocidade a) Reação de 1ª ordem: V = k [S] (uni molecular) b) Reação de 2ª ordem: V = k [S1][S2] k  M-1 S-1 (bi molecular) Obs. uma pequena diminuição na energia de ativação, corresponde a um grande aumento na velocidade da reação

16. Vantagem da catálise • Reação com vários passos: velocidade é determinada pelo passo com a mais alta ∆G++ • Energia de ativação: barreira energética para as reações químicas. • Seletividade celular: reações necessárias para sobrevivência da célula: ∆G++ menores;

17. Quem faz a catálise? • Catalisador = qualquer molécula que facilite a reação. • Participa da reação, mas ao final é recuperado de forma a não ser alterado nem consumido na reação. • Os reagentes e o catalisador encontram-se na mesma fase, geralmente é líquida; • A reação evolui através de espécies intermédios com menor energia de ativação; • A reação tem mais do que um passo. E + S ESEP E + P

18. Tipo de catálise

19. Biomoléculas e a catálise • Carboidratos • Lipídeos • Proteínas

20. Proteínas funcionais • Seqüência amino acídica é quase infinita • Combinação de 20 aminoácidos sem limite de número e repetições • Formação estrutural multivariável • Adaptação a vários estados e ambientes

22. Enzimas = Proteínas funcionais Proteínas altamente especializadas com extraordinário poder catalítico.

23. O Estado de Transição de produto e substrato na ausência de um catalisador ou enzima. As enzimas reduzem a energia de ativação sem alterar a constante de equilíbrio acelerando o processo da reação.

24. O que há de especializado na função da enzima? • Alto grau de especificidade pelo substrato; • Aceleram as reações; • Atividade depende da temperatura, pH, substrato, co-fatores e produto; • São as principais responsáveis para cada processo bioquímico: catabolismo e Anabolismo

25. O que confere a enzima catalisar reações bioquímicas? • Estrutura especializada voltada ao substrato • A forma complementar, carga e características hidrofílicas/hidrofóbicas, são responsáveis por esta especificidade.

26. Catálise enzimática

28. O Ajuste Induzido Mudança conformacional na hexoquinase induzida pela ligação da glicose em seu sítio ativo, faz com que a enzima seja ativada.

29. A Enzima é Complementar a seu Substrato no Estado de Transição

30. História da Enzimologia Pasteur declarou que "a fermentação alcoólica é um ato correlacionado com a vida e organização das células do fermento (levedura), e não com a sua morte ou putrefação". Enzima – do grego ενζυμον, “levedar” ou fermentar – Kuhne 1878; Buchner provou que extratos de levedura tinham a capacidade de fermentar - 1897

31. Histórico • Sumner provou que as enzimas eram proteínas através da cristalização da urease – 1926; • John Northrop e Wendell Meredith Stanley confirmaram as enzimas como proteínas pelo estudo da tripsina, quimotripsina e pepsina – 1930. • Próximo passo é o estudo da catálise enzimática ao nível quântico.

32. Especificidade Eficiência • Ação da enzima no substrato é dependente de: • Presença de substrato em concentração adequada; • pH • Temperatura • Concentração de produto; • Cofatores • Meio (sólido ou líquido)

33. COFATORES necessários para o funcionamento da enzima Coenzima: quando o cofator não se liga covalentemente à enzima Grupo prostético: quando o cofator se liga covalentemente à enzima Holoenzima: enzima + cofator (enzima cataliticamente ativa) Apoenzima ou apoproteína: refere-se somente a parte protéica da enzima As enzimas reguladas por modificações não-covalentes são chamadas de alostéricas.

34. Cofatores inorgânicos: íons

35. A Catálise Enzimática e o Complexo Enzima-Substrato Quimiotripsina O centro ativo: região da enzima onde ocorre a catálise Sítio ativo – porção da estrutura protéica da enzima onde liga-se o substrato

36. Coenzimas

37. ATP + GLICOSE ADP + GLICOSE-6-FOSFATO Nome comum da enzima: Hexoquinase Nome sistemático: ATP:Glicose fosfotransferase Classificação: E.C.2.7.1.1

38. ATP:Glicose fosfotransferase E.C.2.7.1.1 [EC number]: número de comissão da enzima 2  transferase 7  sub-classe: fosfotransferase 1  grupo hidroxil (como grupo aceptor) 1  D- glicose que aceita o grupo fosforil. Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular. www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.

39. Nomenclatura das enzimas ATP:Glicose fosfotransferase E.C.2.7.1.1 [EC number]: número de comissão da enzima 2  transferase 7  sub-classe: fosfotransferase 1  grupo hidroxil (como grupo aceptor) 1  D- glicose que aceita o grupo fosforil. Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular. www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.

40. Cinética enzimática

41. Efeito da Concentração do Substrato na Velocidade Inicial de uma Reação Enzimática [E] = constante e limitante Equação de Michaelis-Menten

42. Quando [S] tende a zero (reação de 1ª ordem) Quando [S] tende para infinito (reação de ordem zero) Constante de Michaelis-Menten (Km) É a concentração do substrato [S], quando Vo = Vmax/2

43. A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN • k1 k2 • Modelo Cinético: E + S ES E + P k-1 K-2 • Aproximações: • Admitindo-se a reação em seu início: • k1 k2 • E + S ES E + P • k-1 • 2. Considerando-se a segunda etapa como passo limitante, tem-se que a velocidade inicial da reação (Vo) é dada por: • Vo = k2 [ES] (eq. 1)

44. A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN 3. Considera-se que a concentração de S é muito maior que a de enzima e despreza-se a quantidade de substrato complexada com a enzima, em relação à concentração total de substrato Note que, numa reação enzimática, a enzima se encontra na forma livre (EL) e na forma complexada com o substrato (ES), daí: [EL] = [ET] - [ES] 4. Considerando-se estado estacionário, a concentração de ES permanece constante, ou seja, a velocidade de sua formação (Vf) é igual à de seu desaparecimento (Vd) Vf = k1 [EL][S] ou Vf = k1 ([ET] – [ES]) [S] (eq. 2) Vd = k2 [ES] + k-1 [ES] ( eq. 3)

45. A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN Igualando a eq. 2 com a eq. 3 e rearranjo os termos, temos: [ET] [S] [ES] = (eq. 4) [S] + Km onde, Km = (k-1+k2)/k1 (Constante de Michaelis-Menten) Combinando a eq. 1 com a eq. 4, temos: k2[ET] [S] Vmax [S] Vo = ou Vo = [S] + Km [S] + Km

46. O gráfico de 1/vo x 1/[S] A forma dos inversos da equação de Michaelis-Menten ou equação de Lineweaver-Burk Modo mais correto de se determinar Vmax e Km

47. O significado de Km e a afinidade enzimática Se k2 << k-1, tem-se que Km = k-1/k1 e, portanto a constante de dissociação do complexo ES

48. Reações que ocorrem em várias etapas em que o passo EP E + P é o limitante Passo limitante kcat = k3 e [EP] ~[Et] kcat é denominado de número de renovação: equivale ao n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única enzima em uma dada unidade de tempo, quando a enzima está saturada com o substrato

49. A Relação kcat/Km Para [S] << Km Vo depende da concentração de dois reagentes e o termo kcat/Km é um constante de 2ª ordem. É considerado o melhor parâmetro cinético para comparar eficiência catalítica

50. Reações com Dois ou Mais Substratos (Mecanismo de dupla troca ou pingue-pongue)