Aula de enzimologia Tema Estratégias de purificação de enzimas

1. Aula de enzimologia Tema Estratégias de purificação de enzimas Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP adriane@debiq.eel.usp.br

2. CONTEÚDO: • Extração da enzima (intra ou extracelular) • Clarificação do meio • Concentração • Métodos cromatográficos • Critério de Pureza

3. com detergente por ultra-som Material na fonte células Homogeneização (para romper tecidos e células) tecidos Homogenado ou Extrato bruto Material de partida por pressão (prensa francesa) liquefação (Potter) Extração de enzimas intracelulares Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.

4. Proteínas de membrana ,. detergente micelas Dependendo da concentração Proteínas integrais da membrana Complexos não micelares Detergentes iônicos Detergentes não iônicos Triton X-100 (polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol) Cetab Cetyltrimethylammonium bromide SDS Dodecil sulfato de sódio Octilglicosídeo (octyl-b-D-glucopyranoside)

5. Propriedades das proteínas e seu efeito no desenvolvimento de estratégias de purificação Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas: 1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (fase reversa) Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

6. Remoção de cor dos extratos Alguns procedimentos de purificação devem incluir uma etapa prévia de remoção de cor dos extratos. Cor pode ser devida à produção de pigmentos pelos microrganismos ou pela presença de substratos complexos usados no meio de crescimento (lignocelulósicos, efluentes, etc.) Substâncias responsáveis da cor podem ligar-se fortemente às proteínas dificultando sua separação e diminuindo sua atividade Remoçao da cor por adsorção: DEAE-celulose PVP (Polivinilpirrolidona) Carvão ativado

7. Estrutura do PVPP Adsorção de catequinas a PVPP Carvao ativado

8. NaCl KCl MgSO4 Solubilidade da hemoglobina (S/S’) (NH4)2SO4 Salting-in X Salting-out K2SO4 Concentração do Sal,, Molar Métodos de concentração de proteínas 1) Precipitação A precipitação de proteínas pode ser induzida por: - adição de sais (Precipitação salina) - adição de solventes - variação de pH (Precipitação isoelétrica)

9. Hemoglobina Albumina Mioglobina Solubilidade, log Pseudoglobulina Fibrinogênio Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar Sais se dissociam em solucão aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação. - precipitam primeiro: proteínas maiores proteínas mais hidrofóbicas possuem camadas de solvatação maiores ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar. Proteínas apresentam diferente sensibilidade para a precipitação salina.

10. Precipitação com Sulfato de amônio • Porcentagem de Saturação = concentração do sal em solução como uma porcentagem da concentração máxima possível a uma dada temperatura • Vol específico = volume ocupado por 1 g de sal (ml/g)= recíproco da densidade • Ex. O volume específico do sulfato de amonio sólido é 0,565 ml/g. A sua solubilidade a 0oC é 706 g/1000 g água. • Calcular • concentração de sulfato de amonio numa solução saturada a 0oC: • 1000 + (706) (0,565) ml = 1399 ml 706g/1399 ml = 505 g/l • 505/ 132,14 = 3,82 M

11. Precipitação fracionada b) quantidade de sulfato de amônio sólido que deve ser adicionado a 0oC a 560 ml de uma solução 40% saturada para levá-la a 60% de saturação? Podemos deduzir uma equação simples que dará a quantidade de sulfato de amônio que deverá ser adicionado a 1000 ml de solução 0,505 g/ml = 100% de saturação (ou 1) S2= (massa inicial de sulf. Amonio) + (massa de sulf amonio adic.) (vol final ) (0,505 g/ml) S2 = (1000 ml). (0,505 g/ml).S1 + m.S2 [(1000ml + 0,565ml/g . (m) ]. 0.505 g/ml S2 = 505.S1 + mS2 505 + 0,285m S2.505 + 0,285S2m = 505S1 + mS2 m = (S2 – S1)505 1- 0,285

12. Aos precipitados obtidos com sal ou solvente, adiciona-se água. Ao precipitado obtido com variação de pH, retornar ao pH original. Membrana de celofane solvente solução a ser dialisada Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação. final início Dt Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.

13. Constante Dielétrica Momento Dipolar Solvente Água Dimetilformamida Metanol Etanol Acetona Clorofórmio Benzeno 78.5 1.85 48.9 3.96 32.6 1.66 24.3 1.68 20.7 2.72 4.8 1.15 2.3 0.00 2) Precipitação com solvente orgânico • Acetona, etanol, metanol, n-propanol, dioxano, etc. • Tamanho da molécula • pI Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. % etanol = V etanol x 100................ Vtampao + Vamostra + Vetanol

14. Proteína P.I. Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam a camada de solvatação menos organizada. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

15. Métodos de concentração de proteínas

16. Purificação por cromatografia

17. Coletor de frações Concentração Tempo ou volume FUNCIONAMENTO BÁSICO DE UMA COLUNA CROMATOGRÁFICA • Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como: • massa molecular • carga elétrica • solubilidade • afinidade

18. CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL PROPRIEDADES IMPORTANTES Limite de Exclusão Moléculas pequenas não podem difundir no interior do gel Moléculas > ao limite eluiram rapidamente do gel Ex: Sephadex G-50 Limite de exclusao = 30.000 Moléculas com MM > 30.000 eluiram diretamente sem entrar nas partículas do gel Faixa de Separação Sephadex G-50 faixa de : 1.500-30.000 Moléculas dentro dessa faixa serão separadas neste gel

19. Volume de Vazio Espaço total que rodeia as partículas do gel na coluna empacotada que é determinado através do volume de solvente requerido para eluir um soluto que é completamente excluído da Coluna Ex.: Blue Dextran (MM= 2.000.000)

20. traçado da medida de atividade biológica nas frações 25 50 75 100 125 mL volume de eluição A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molar. Curva de calibração Observar a escala log Moléculas maiores Moléculas menores Massa molecular (kD) Absorbância a 280 nm Medida da ativ. biológica Ler a massa correspondente 20 40 60 80 100 120 mL volume Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao. Kav

21. indica quais os tamanhos das partículas que podem entrar nos poros da resina e serem fracionados. Acima ou abaixo da faixa, não há separação. Resinas para Gel-Filtração TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO NOME (kD) Sephadex G - 10 Dextrana 0.05 - 0.70 Sephadex G - 25 Dextrana 1 - 5 Sephadex G - 50 Dextrana 1 - 30 Sephadex G - 100 Dextrana 4 - 150 Sephadex G - 200 Dextrana 5 - 600 Bio - Gel P - 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 Bio - Gel P - 6 Policrilamida 1 - 6 Bio - Gel P - 10 Policrilamida 1.5 - 20 Bio - Gel P - 30 Policrilamida 2.4 - 40 Bio - Gel P - 100 Policrilamida 5 - 100 Bio - Gel P - 300 Policrilamida 60 - 400 Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000 Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000 *Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio - Rad Laboratories Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas Moléculas pequenas Proteínas Moléculas pequenas Proteínas Células, partículas sub-celulares

22. Kav = Ve-Vo Vt-Vo Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. onde: Ve – volume de eluição de uma certa proteína Vt – volume total da coluna Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com massa acima da resolução da resina

23. CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA PROPRIEDADES • As colunas de troca iônica podem • apresentar carga (+) ou (-) segundo • o grupo funcional ligado à matriz • da coluna • DEAE-Celulose : dietilaminoetil • CM-Celulose : carboximetil - Resina aniônica (+) : troca anions - Resina cationica (-) : troca cátions - Resinas trocadoras podem ser fortes ou fracas • Proteína ligada reversivelmente • na resina pode ser eluida da coluna • por aumento da força ionica ou • mudanças no pH

24. Método de eluição mais utilizado é o gradiente de NaCl • Logo da eluição a proteína de interesse encontra-se purificada e concentrada • Para escolher o tipo de resina, • anionica ou cationica, deve se • considerar o pI da proteína de • interesse

25. Para proteínas com um pI inferior a 7 ou desconhecido • recomenda-se a utilizaçao de um trocador aniônico forte

26. NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH N+(CH ) Troca aniônica 2 3 3 resina de polistireno Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO -H Troca Catiônica 3 resina de polistireno DEAE - celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas - CH CH N+(C H ) ácidas e neutras 2 2 2 5 2 CM - celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas - CH COOH básicas e neutras 2 DEAE - Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração básico - CH CH N+(C H ) e troca iônica de proteínas 2 2 2 5 2 ácidas e neutras CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração ácido - CH COOH e troca iônica de proteínas 2 básicas e neutras * Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio Rad Laboratories Tipos de Resina de troca Iônica Tipos de Resina de troca Iônica Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

27. Cromatografia de afinidade: IMAC - Cromatografia de afinidade com metal imobilizado • interação entre as proteínas e os ions metálicos imobilizados num suporte sólido. • suportes contendo ions de Cu2+ ,Ni2+ , Zn2+ ou Co2+ são apropriados para o fracionamento de proteínas com base no seu conteúdo relativo de resíduos de histidina, cisteína, cadeias laterais aromáticas de aminoácidos e de grupos N-terminal acessíveis de aminoácidos. • cauda de his Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre (imidazol)

28. Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade 1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo - análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores - haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com “tag” ou “marcação” - glutationa-S-transferase - poli-Histidina 2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

29. 3 passos cromatográficos consecutivos usados para purificar uma proteína. Em A, resultados de uma coluna de troca iônica; B, Filtração em gel e C, Cromatografia de afinidade.

30. matriz hidrofóbica H Proteína altamente hidrofílica P Proteína menos hidrofílica P camada de H2O solvatação [sal] [Proteína] volume Cromatografia de interação hidrofóbica É um processo de partição que explora a interação entre aminoácidos apolares de uma proteína e uma matriz de caráter hidrofóbico. Proteínas em solução salina concentrada “perdem” parte da camada de solvatação para os sais, expondo na superfície regiões ricas em aminoácidos apolares, que interagem com uma matriz hidrofóbica Três estratégias para eluição: 1. diminuir a concentração de sal 2. diminuir a polaridade da fase móvel 3. adicionar detergente Força da interação hidrofóbica aumenta com o tamanho da cadeia de C na resina: Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8)

31. Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ? • Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína: • Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida • através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes • em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação. • Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína • de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades • específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura). • Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de • partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces- sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas • que apresentam pouca atividade). • Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse.

32. CARATERIZAÇÃO DAS FRAÇÕES ELUIDAS DAS COLUNAS CROMATOGRÁFICAS • Quantificação de proteinas nos volumes eluidos das colunas por espectrofotometria Leitura da Abs em 280 nm (UV), rápido e simples • Determinação das atividades enzimáticas nas frações que apresentam proteína (Abs280nm) são determinadas as atividades enzimáticas de interesse • Algumas proteinas apresentam propriedades espectrais caracteristicas que permitem seu seguimento durante a cromatografia Peroxidases : Banda Soret (Abs em 406-409 nm) Lacases : Abs em 600 nm (cor azul)

33. TABELA DE PURIFICAÇÃO

34. TÉCNICA UTILIZADA COMO CRITÉRIO DE PUREZA ELETROFORESE A eletroforese é uma técnica relativamente simples e rápida e de alto valor informativo, que consiste na migração de molécula ionizadas de acordo com suas cargas elétricas e massa molar, submetidas a um campo elétrico • O suporte mais utilizado para conduzir a eletroforese é o gel de poliacrilamida, em condições nativas (PAGE) e desnaturantes (SDS-PAGE) • Sistema SDS-PAGE serve para a determinação da massa molar das proteínas presentes em uma amostra

35. H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- Desnaturação de proteínas por SDS Sódio dodecil sulfato A porção hidrocarboneto do detergente interage com as regiões hidrofóbicas da proteína, dispondo o grupo sulfato carregado na superfície, em contacto com o meio aquoso. A repulsão entre os grupos fosfato desestabiliza os laços não covalentes que mantém a estrutura 3D da proteína, desnaturando-a.

36. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE) O desenho ao lado mostra o tipo mais comum de cuba para PAGE. Na cuba, o gel é polimerizado entre duas placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm uma da outra. amostra Poços para as amostras catodo 1 mm tampão Placas de vidro gel anodo tampão cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

37. O SISTEMA PAGE É USADO PARA A ANÁLISE DO PADRÃO • DE PROTEÍNAS NATIVAS PRESENTES NUMA AMOSTRA • A quantidade de bandas que aparecem no gel é um indicativo da pureza de uma amostra

38. SDS-PAGE- permite determinar a massa molecular de proteínas 97.4 87.0 45.0 29.0 21.0 12.5 6.5 (-) Massa molecular (kD) Mobilidade relativa (+) Mr Mobilidade relativa = distância percorrida pela banda X distância percorrida pelo marcador da corrida Curva de calibração de SDS-PAGE Proteínas padrões em um SDS-PAGE

39. Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE) • 1975 - surge a 2D-PAGE . Trabalhos de O´Farrel; Klose ; MacGillivray et al. • Etapas Básicas: • 1- Focalização Isoelétrica (IEF) • 2-Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 2D-PAGE: etapas principais • Preparação da amostra • Focalização Isoelétrica • SDS-PAGE • Detecção • Digitalização e análise de imagem

41. Terminamos aqui a aula de purificação do curso de Enzimologia • Material para leitura: • Purificação de Produtos Biotecnológicos , Editora Manole, Adalberto Pessoa Jr, Beatriz Kilikian (coordenadores) . • 2. Eletroforese de isoenzimas e proteínas afins; fundamentos e aplicações em plantas e microrganismos – Acelino Couto Alfenas, 1998, 574p. Na aula prática, vocês terão oportunidade de ver alguns tipos de cromatografia funcionando.