Quali sono gli strumenti a disposizione dell’istologo per lo studio della cellula e dei tessuti?

1. Quali sono gli strumenti a disposizione dell’istologo per lo studio della cellula e dei tessuti?

2. ordine di grandezza delle strutture di interesse istologico • in questo corso raramente ci soffermeremo sulle esatte dimensioni delle strutture oggetto di studio • è però di fondamentale importanza conoscere l’ordine di grandezza di tali strutture

3. Cosa significa “ordine di grandezza”? • Semplificando:due oggetti differiscono di un ordine di grandezza quando uno è circa 10 volte più grande dell’altro

4. Importanza degli ordini di grandezza quale sarebbe l’esito di questo incidente?

5. può una proteina attraversare la membrana tramite un canale ionico?

6. scale lineari e scale logaritmiche In una scala logaritimica, il valore di ogni suddivisione si ottiene moltiplicando (o dividendo) il valore della suddivisione precedente. In questa scala, il fattore è 10

7. Questione di dimensioni… spessore di un capello umano cellule epiteliali globuli rossi batteri le frecce bianche indicano l’ordine di grandezza di alcune strutture biologiche e chimiche virus proteine aminoacidi atomi

8. - l’organismo è composto di cellule - esistono molti tipi diversi di cellule immagine istologica

9. immagine istologica tipicamente, cellule relativamente simili fra loro si aggregano … …formando i cosiddetti tessuti. L’istologia può anche essere definita come lo studio dei tessuti dell’organismo

10. immagine istologica cosa si osserva?

11. Anatomia del microscopio ottico o “luce”

12. schema di funzionamento di un moderno microscopio ottico bx51 interior

13. come si ottiene, a partire da tessuti biologici, un’immagine come questa? immagine istologica

14. Problema 1 La preparazione di materiale istologico • la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto • il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

15. microtomo a slitta

16. microtomi elettronici

17. Problema 2 La preparazione di materiale istologico • i tessuti biologici sono per lo più molli • prima del taglio, il tessuto deve essere indurito • Fissazione con aldeidi • Inclusione • Congelamento

18. criostato

19. Problema 3 La preparazione di materiale istologico • i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto • prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato • coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

20. acidofilia e basofilia • le sostanze acide che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti basici (basofilia) • le sostanze basiche che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti acidi (acidofilia o eosinofilia)

21. acidofilo (eosinofilo) diversi tipi di granulociti basofilo neutrofilo

22. sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica • fissazione di un campione di tessuto in formaldeide • congelamento del pezzo • taglio al microtomo • montaggio su vetrino • “bagni” in soluzioni di coloranti • disidratazione e coverslipping

23. lo strisciodi sangue Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

24. striscio

25. Istologia “funzionale” • Colture cellulari • Coloranti vitali • Istochimica • Immunoistochimica • Immunofluorescenza • Tecniche speciali • Traccianti assonali • Tecniche combinate L’istologia moderna non si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. Esistono numerose tecniche che consentono di rispondere a quesiti su specifici correlati funzionali della composizione di un tessuto

26. Citochimica e Istochimica • L’identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti Mentre nella biochimica tradizionale il materiale biologico viene studiato tipicamente “in provetta”, la citochimica e l’istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su sezioni di tessuto, consentendo di identificare i costituenti in situ.

27. Immunofluorescenza e immunoistochimica • Metodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessuti • IF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti • IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica)

28. immagine istologica che livello di dettaglio si apprezza in questa immagine?

29. stesso tessuto a maggiore ingrandimento

30. è sufficiente il microscopio ottico a “saziare” ogni curiosità sulle strutture viventi? ulteriore ingrandimento...

31. Questione di dimensioni… Occhio umano cell. epiteliali globuli rossi batteri Microscopio ottico virus proteine le frecce indicano il massimo potere risolutivo di alcuni strumenti di osservazione aminoacidi atomi

32. Che differenza c’è fra:ingrandimentoe potere di risoluzione?

35. Questo è quello che succede quando si ingrandisce indefinitamente un’immagine.

36. Aumentare a piacimento la risoluzione di un’immagine già acquisita è possibile solo nei film americani...

37. il potere risolutivo dello strumento di osservazione determina il livello di dettaglio contenuto nell’immagine. L’ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini

38. di conseguenza, l’ulteriore ingrandimento di questa immagine non rivela maggiori dettagli

39. il microscopio elettronico a trasmissione per fortuna esiste...

40. m. ottico em. elettronico a confronto

41. Microscopia elettronica • Preparazione del tessuto • Fissazione in glutaraldeide • Postfissazione in tetrossido di osmio • Disidratazione con alcol • Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche • Taglio all’ultramicrotomo • Sezioni ultrafini di 20-40 nm • Aumento del contrasto • Coloranti elettronici come acetato di uranile o citrato di piombo

42. ultramicrotomo

43. l’ultramicrotomo produce tipicamente sezioni di 50-70 nm

44. Esempio di microscopia elettronica a trasmissione Le immagini di microscopia elettronica sono “in bianco e nero”. Le parti “scure” si dicono elettrondense. L’altissimo potere risolutivo del ME consente di distinguere numerose componenti subcellulari. linfocito

45. la luce incide sull’oggetto e viene riflessa da esso si osservano oggetti in rilievo stereomicroscopio

46. poi c’è anche... Microscopio elettronico a scansione

47. Microscopio elettronico a scansione • Risoluzione inferiore rispetto alla ME a trasmissione • Consente di valutare il rilievo degli oggetti • Usata per lo studio delle superfici cellulari

48. Questione di dimensioni… Occhio umano cell. epiteliali l’osservazione di diversi livelli di organizzazione della materia vivente richiede l’uso di diversi strumenti globuli rossi batteri Microscopio ottico virus Microscopio elettronico a scansione proteine aminoacidi Microscopio elettronico a trasmissione atomi

49. capello alcuni esempi di microscopia elettronica a scansione…

50. formica