Najważniejsze odmiany techniki PCR

1. Najważniejsze odmiany techniki PCR Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR) Celem asymetrycznego PCR jest amplifikacja jednoniciowego DNA o określonej długości. Taki zsyntetyzowany przez reakcję PCR produkt może być stosowany jako: specyficzna sonda molekularna w hybrydyzacji, matryca w reakcjach sekwencjonowania DNA.

2. Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR) Asymetryczny PCR można wykonać w dwojaki sposób stosując: • jednoetapowa amplifikacja (nierówne stężenie primerów od początku reakcji) Produkt amplifikacji otrzymuje się przez zastosowanie dwóch różnych primerów, z których jeden całkowicie ulega wyczerpaniu w czasie pierwszych cykli amplifikacji. W następnych cyklach tylko pozostały w nadmiarze primer może ulegać elongacji, dając właściwy produkt asymetrycznego PCR - jednoniciowy DNA o określonej długości. Amplifikacja od momentu wyczerpania się jednego z primerów nie zachodzi już w sposób ekspotencjalny, lecz liniowy.Ta metoda wymaga dużej liczby cykli, a to jest potencjalnym źródłem błędów w inkorporacji właściwych nukleotydów.

3. Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR) • dwuetapowa amplifikacja (tylko jeden primer do reamplifikacji jednej nici DNA na matrycy dwuniciowego produktu PCR występującego w mieszaninie reakcyjnej) Jest to metoda o wiele bardziej wydajna, ponieważ startuje się z wysokokopijnej, sprawdzonej, o określonej już pod względem długości matrycy DNA (jest to ważne ze względu na liniowy charakter amplifikacji). Stosując tą technikę można zamplifikować kilka pmoli pojedynczo-niciowego DNA (ssDNA). Taka ilość ssDNA może już być analizowana w barwionym bromkiem etydyny żelu agarozowym.

4. Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP, ARMS) (ang. allelo-specific amplification) • Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA), jest również nazywana PASA (ang. PCR Amplification of Specific Alleles), ASP (ang. Allele-Specific PCR) lub ARMS (ang. Amplification Refractory Mutation System). • Podstawą tej odmiany techniki PCR jest założenie, że niekomplementarność nukleotydów przy końcu 3' jednego lub obu stosowanych primerów zapobiega elongacji końca 3' primera przez polimerazę Taq. Oczywistym jest więc, że można tutaj stosować tylko polimerazy DNA pozbawione aktywności 3'-5' egzonukleazy.

5. Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP, ARMS) (ang. allelo-specific amplification) • Wydajna inicjacja syntezy DNA w takim PCR jest determinowana przez sekwencję ostatniego lub dwóch ostatnich nukleotydów na końcu 3' primerów. • Jeśli są one komplementarne do matrycy, to badane allele są wydajnie amplifikowane, a przy braku komplementarności dla innych alleli, amplifikacja ich jest zahamowana. • Zaleca się stosowanie krótkich primerów (np. 14 nt). Każdy allel musi być testowany w oddzielnej probówce reakcyjnej. Stąd, ASA wymaga bezwzględnie koamplifikacji kontrolnego DNA dla sprawdzenia możliwego zahamowania reakcji. Stosowanie takiej kontroli jest kluczowe w tej metodzie, ponieważ brak produktu w reakcji ma takie same znaczenie diagnostyczne jak jego obecność.

6. Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP, ARMS) (ang. allelo-specific amplification) ASA jest metodą wykrywania polimorfizmu alleli, istnienia punktowych mutacji i jest wykorzystywana do: • wyjaśniania mechanizmu badanej choroby, • wyjaśniania ewolucyjnych powiązań między gatunkami, • badania mechanizmu działania substancji mutagennych, • wykrywania sprzężonych z chorobą genów w diagnostyce pewnych chorób, • badania zasad powstawania oporności przeciw chemioterapeutykom u mikroorganizmów, • badania powiązań genetycznych.

7. Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP, ARMS) (ang. allelo-specific amplification)

8. Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR) • Metoda ta polega na zastosowaniu wewnętrznej pary primerów w stosunku do preegzystującego produktu amplifikacji (dwuetapowa amplifikacja). • Produkt tej reakcji może być stosowany jako: • sonda molekularna w hybrydyzacji, • kontrola specyficzności amplifikacji matrycy.

9. Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR) • Dla celów diagnostycznych (aby wyeliminować możliwość kontaminacji) stosuje się reakcję wewnętrznego PCR w jednej probówce reakcyjnej (jednoetapowa amplifikacja) z użyciem dwóch par primerów charakteryzującymi się różnymi temperaturami topnienia (Tm). • Hybrydyzacja wewnętrznych primerów podczas pierwszych cykli jest hamowana z powodu ich niskiej temperatury topnienia (np. Tm dla pary primerów zewnętrznych wynosi 80C, a dla pary primerów wewnętrznych - 45C).

10. Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR) • W pierwszych cyklach takiej reakcji PCR zachodzi amplifikacja długiego fragmentu DNA z udziałem primerów zewnętrznych (15-20 cykli, dwutemperaturowy profil reakcji: denaturacja 95C przez 20 s, dołączanie primerów i elongacja w 72C przez 30 s). • Następne 16 cykli wykonuje się w następujący sposób: denaturacja przy 92C przez 20 s, dołączanie primerów przez 20 s, redukując temperaturę o 2C co 2 cykle startując od temperatury 66C i elongacja przy 72C przez 20 s. Na tym etapie wytwarzają się produkty różnej wielkości (resztkowa amplifikacja z udziałem primerów zewnętrznych, mieszane produkty powstałe na bazie primera zewnętrznego i wewnętrznego i produkty amplifikacji z primerami wewnętrznymi. • Trzeci etap reakcji to wytwarzanie tylko krótkich fragmentów z wykorzystaniem primerów wewnętrznych (37-45 cykli, denaturacja 88C przez 20 s, dołączanie primerów 50C przez 20 s, elongacja przy 72C przez 20 s.

11. Multipleksowy PCR (ang. multiplex PCR) • Metoda ta pozwala na równoczesną amplifikację kilku regionów genomu w jednej probówce przy zastosowaniu różnych par primerów. • Taka równoczesna amplifikacja więcej niż jednego regionu DNA w jednej mieszaninie reakcyjnej obniża koszty eksperymentów, oszczędza pracę i czas, a także zmniejsza ryzyko kontaminacji. • Ta odmiana techniki PCR znalazła szerokie zastosowanie, np. do wykrywania czynników zakaźnych, diagnostyki chorób genetycznie uwarunkowanych, wykrywania różnego typu mutacji.

12. Różnicowy PCR (ang. differential PCR) • Podstawą różnicowego PCR jest możliwość amplifikacji genu targetowego i fragmentu odnośnikowego w tej samej probówce reakcyjnej. • Taka równoczesna amplifikacja ilościowo określonego fragmentu odnośnikowego i fragmentu o nieznanej liczbie kopii w jednej probówce może posłużyć do ilościowego określenia sekwencji targetowej.

13. Amplifikacja nieznanych sekwencji • Możliwość specyficznej amplifikacji DNA zależy od tego czy znamy jego sekwencję nukleotydową. Często jednak dysponujemy matrycowym DNA, którego sekwencja nukleotydowa jest całkowicie nieznana, a dysponujemy tylko znajomością sekwencji nukleotydowej pokrewnych genów pochodzących z innych gatunków. W takich sytuacjach jednak amplifikacja PCR jest również możliwa przy zastosowaniu zdegenerowanych primerów oligonukleotydowych (tzw. primery uniwersalne). • Inną strategią jest zaprojektowanie primerów na podstawie znajomości sekwencji aminokwasowej peptydów lub białek. To podejście napotyka trudności ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego (większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jeden kodon). Stąd, primery projektowane na podstawie sekwencji aminokwasowej powinny być w pełni redundentne. Z tego też względu na ogół stosuje się krótkie primery, np. stosunkowo krótki primer złożony z 15 nukleotydów ma już 512 różnych permutacji.

14. Sekwencja nukleotydowa primera ustalona na podstawie sekwencji aminokwasowej peptydu

15. Amplifikacja nieznanych sekwencji • Pewnym rozwiązaniem w amplifikacji nieznanych sekwencji jest zastosowanie uniwersalnej zasady jaką jest inozyna, którą można podstawić w miejscach okupowanych przez 3 lub 4 różne zasady. Inozyna jest zasadą purynową, naturalnie występującą w rzadko występującym nukleotydzie pewnych rodzaji tRNA i ma zdolność parowania z wszystkimi czteroma podstawowymi zasadami (A, C, G, T). Nie zaleca się stosowania inozynowych nukleotydów przy końcu 3' primera. • Zastosowanie wysoce zdegenerowanych primerów do reakcji PCR nie wymaga żadnych specyficznych warunków reakcji, chociaż obniżenie temperatury dołączania primerów może być konieczne w niektórych przypadkach.

16. Czynniki wpływające na efektywność PCR • Wiele różnych czynników może wpływać na efektywność amplifikacji DNA metodą PCR. Oczywistym jest, że w zoptymalizowanym systemie niewielka zmiana jednego lub kilku zasadniczych czynników reakcji będzie miała duży wpływ na efektywność procesu. • Najbardziej czułymi na zmiany elementami reakcji PCR są: • stężenie jonów Mg, • dNTP, • aktywność polimerazy Taq, • zmiana profilu temperaturowego cyklu, a szczególnie zmiana temperatury dołączania primerów.

17. Czynniki wpływające na efektywność PCR Stwierdzono na przykład, że: • 10 mM MgCl2 hamuje aktywność polimerazy Taq w 40-50%, • gdy stężenie jonów jednowartościowych przekroczy 75 mM KCl obserwowany jest wyraźny efekt hamujący. Nawet w przypadku zoptymalizowania parametrów reakcji PCR, wyniki mogą być niesatysfakcjonujące i wtedy należy rozważyć wpływ innych cznników mogących obniżać efektywność. Do nich należą między innymi: • natura natywnego materiału matrycy, • stosowana metoda do izolacji matrycowego DNA, • związki chemiczne użyte do izolacji DNA i w śladowych ilościach wprowadzone do próbki reakcyjnej PCR.

18. Czynniki wpływające na efektywność PCR Hamowanie przez analizowany materiał Typowymi źródłami matrycowego DNA dla reakcji PCR w diagnostyce są między innymi: • mocz, • krew obwodowa, • wymazy komórkowe, • ślina, • płyn mózgowo rdzeniowy, • materiały biopsji.

19. Czynniki wpływające na efektywność PCR • Mocz zawiera wiele inhibitorów reakcji PCR. Izolacja matrycowego DNA z moczu jest prosta. Polega na 10 min gotowaniu próbki moczu, co wystarcza do uwolnienia DNA z materiału komórkowego i cząstek zakaźnych (np. wirusów) przez hydrolizę struktur białkowych. Takie próbki DNA muszą zostać rozcieńczone, aby nie hamowały reakcji PCR. Z drugiej jednak strony rozcieńczenie obniża ilość czynników zakaźnych w jednostce objętości, co oczywiście utrudnia nieraz wykrywalność patogenów (trudna interpretacja wyników negatywnych). Trudno dokładnie określić naturę tych inhibitorów, stąd reakcje PCR z takimi nieznanymi substancjami inhibitorowymi wymagają bezwzględnie dobrych próbek kontrolnych, które określą aktualną wrażliwość na inhibicję.

20. Czynniki wpływające na efektywność PCR • Stosowanie krwi obwodowej jako źródło matrycowego DNA czasami czyni pewne problemy. • Próbki krwi powinny być pobierane do probówek zawierających EDTA (1 mg/ml) jako antykoagulenta. • Próbki pobierane na heparynę (14.3 U/ml krwi) nie nadają się do celów PCR. Heparyna całkowicie hamuje amplifikację matrycowego DNA podczas PCR. Taki efekt działania heparyny nie może być zniesiony przez żadną ze znanych metod izolacji i oczyszczania DNA. Jedyną możliwością jest inkubowanie DNA z heparynazą I lub II. • Ekstrakcja DNA z krwi powinna wyeliminować zanieczyszczenia związkami porfirynowymi pochodzącymi z hemu (dobre oddzielenie erytrocytów od leukocytów). Są one substancjami najsilniej hamującymi reakcje PCR wykonywanych z matrycowym DNA otrzymywanym z krwi. Pozbawione porfiryn próbki DNA z krwi najwydajniej otrzymuje się poddając najpierw wybiórczej lizie erytrocyty, a następnie leukocyty selektywnie osadza się przez wirowanie i przemywa buforem. Z oczyszczonych od erytrocytów komórek leukocytów izoluje się DNA, który jest pozbawiony porfiryn.

21. Hamowanie przez związki chemiczne stosowane do izolacji DNA • Powszechnie do izolacji DNA używa się detergentów potrzebnych do lizy komórek i denaturacji białek związanych z kwasami nukleinowymi. • Detergenty ogólnie można podzielić na niejonowe i jonowe. Nonidet P-40, Tween 20, Triton X-1000 i N-oktyloglikozyd należą do grupy detergentów niejonowych. Natomiast dezoksycholan sodu, sarkozyl i sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) należą do grupy detergentów jonowych. • Zastosowanie detergentów niejonowych zamiast detergentów jonowych w izolacji DNA dla celów PCR jest korzystniejsze.

22. Hamowanie przez związki chemiczne stosowane do izolacji DNA • Wykazano, że detergenty niejonowe nie hamują aktywności polimerazy Taq w stężeniach <5%, za wyjątkiem N-oktyloglikozydu, który hamuje reakcję PCR w stężeniach powyżej 0.4%. Stąd, niekonieczna staje się ekstrakcja fenolowa lizatów komórkowych poddanych działaniu proteinazy K z detergentem niejonowym przed nastawieniem reakcji PCR (proteinazę K inaktywuje się termicznie). Zaoszczędza to znacznie czas przygotowania próbki DNA do PCR i redukuje możliwość zaistnienia kontaminacji. • Detergenty jonowe hamują aktywność polimerazy Taq już przy bardzo niskich stężeniach. Jonowe detergenty stosowane do lizy komórek i denaturacji białek muszą być usunięte przez ekstrakcję fenolową i precypitację etanolową przed nastawieniem reakcji PCR. Jest to spowodowane tym, że większość detergentów stosuje się w stężeniach wyższych niż te które są kompatibilne z PCR (np. SDS bardzo często stosuje się w 2% stężeniu końcowym).

23. Hamowanie przez związki chemiczne stosowane do izolacji DNA • Stwierdzono, że 0.001% SDS ma niewielki efekt stymulacyjny na PCR. • Natomiast, 0.01% SDS obniża aktywność polimerazy Taq do 10%, a 0.1% SDS hamuje prawie całkowicie reakcję PCR (aktywność polimerazy Taq <0.1% w stosunku do pełnej aktywności). • Hamujący efekt niskich stężeń SDS może być kompensowany przez pewne niejonowe detergenty (np. 0.5% Tween 20 przeciwdziała hamowaniu reakcji PCR przez 0.1% SDS). Jednak bardziej zalecane jest całkowite usuwanie SDS z próbki DNA. • Wydajną eliminację SDS z próbki DNA uzyskuje się przez ekstrakcję fenolową i następnie precypitację etanolową stosując 0.2 M chlorek sodu zamiast octanu amonu przed dodaniem etanolu, co pozostawia SDS w stanie rozpuszczonym, zapobiegając koprecypitacji SDS z kwasami nukleinowymi.

24. Hamowanie przez związki chemiczne stosowane do izolacji DNA • Proteinaza K jest proteazą często stosowaną w metodach lizy komórek i izolacji DNA. Pozostawienie nawet resztkowej aktywności tego enzymu w mieszaninie reakcyjnej może bardzo szybko zdegradować proteolitycznie polimerazę Taq. Stąd, należy bezwzględnie dobrze zinaktywować proteinazę K przez ogrzanie lizatu komórkowego lub oczyszczonych próbek DNA w temperaturze 95C przez 10 min. • Ślady fenolu w próbce DNA do PCR hamują aktywność polimerazy DNA. Problem ten można wyeliminować usuwając ślady fenolu pochodzącego z ekstrakcji fenolowej przez końcową ekstrakcję DNA mieszaniną chloroform-alkohol izoamylowy (49:1). Następnie DNA precypituje się z etanolem i solą, a resztki soli usuwa się przez przemywanie sprecypitowanego DNA 70-80% etanolem.

25. Hamowanie przez związki chemiczne stosowane do izolacji DNA • Stężenie soli w mieszaninie reakcyjnej w znaczny sposób wpływa na aktywność polimerazy Taq. • 50 mM chlorek amonu daje niewielką inhibicję, • 50 mM octan amonu jest bez wpływu na efektywność reakcji, • 50 mM chlorek sodu stymuluje reakcję o 25-30%. • Powyższe dane trzeba brać pod uwagę, ponieważ koprecypitowane z matrycowym DNA sole mogą wpływać na aktywność polimerazy Taq. • Inne jony wprowadzane do mieszaniny reakcyjnej PCR, np. jony potasu, wpływają na Tm primera. Tę zależność wyraża wzór: Tm = 81.5 + 16.6(log10 [J+]) + 0.41 (%G+C) - (600/l) - 0.63 (%FA).

26. Hamowanie przez związki chemiczne stosowane do izolacji DNA • Badano także wpływ sperminy, spermidyny i poliamin na efektywność reakcji PCR. Wykazano, że: • spermina i spermidyna w stężeniach od 0.5 do 3 mM nie ma wpływu na amplifikację PCR, • według innych autorów obserwuje się wyraźną stymulację amplifikacji PCR przez sperminę lub spermidynę w stężeniach od 0.4 do 0.6 mM, • spermidyna działa skuteczniej od sperminy. • Pokazano również pozytywny wpływ poliamin na amplifikację PCR z optimum przy stężeniu 0.6 mM. Formamid (3%) w kombinacji z poliaminą (0.6 mM) częściowo hamował stymulacyjny efekt poliamin. Taki sam efekt wykazywał także glicerol.

27. Dodatkowe składniki wpływające na efektywność PCR Dodanie pewnych dodatkowych składników do mieszaniny reakcyjnej PCR może wpływać na: • temperaturę topnienia primerów, • termiczny profil aktywności polimerazy Taq, • stopień denaturacji, • ułatwienie dołączania primerów (hamowanie tworzenia struktur drugorzędo-wych primerów).

28. Dodatkowe składniki wpływające na efektywność PCR • Każda specyficzna reakcja PCR pozostaje unikalną. Stąd, działanie dodatkowych składników mieszaniny reakcyjnej PCR jest nierównocenne. Pewne próby reakcyjne mogą być wzmaciane, natomiast na inne ten sam składnik, przy zastosowaniu tych samych stężeń, może nie mieć żadnego wpływu. • Jednym z tych czynników jest DMSO (dwumetylo-sulfotlenek). Jest on silnym denaturantem powodującym lepszą denaturację matrycowego DNA. Stwierdzono, że: • dodanie DMSO do reakcji PCR może eliminować tworzenie struktur drugorzędowych przez primery, • DMSO obniża Tm o 5-6C, • gdy stężenie DMSO przekracza w próbce reakcyjnej 10% obserwuje się 50% zahamowanie aktywności polimerazy Taq.

29. Dodatkowe składniki wpływające na efektywność PCR • Innym czynnikiem jest glicerol, poprawiający efektywność niektórych reakcji PCR przy stężeniu 10-15%. Najprawdopodobniej jego pozytywne działanie polega na: • lepszej denaturacji DNA matrycy i • eliminacji tworzenia się struktur drugorzędowych primerów i matrycy. • Glicerol poprzez swoją zdolność stabilizowania struktury białka ma również wpływ na stabilność polimerazy Taq. Glicerol w stężeniu powyżej 20% powoduje zahamowanie reakcji PCR. • Opublikowano szereg prac wskazujących na dużą użyteczność formamidu w polepszaniu efektywności reakcji PCR. Stwierdzono, że formamid poprawia: • wierność, • powtarzalność wyników, • czułość i • specyficzność amplifikacji, szczególnie gdy targetem jest sekwencja DNA bogata w pary G+C. • Stężenie formamidu poniżej 10% ma na ogół efekt pozytywny na aktywność polimerazy Taq.

30. Dodatkowe składniki wpływające na efektywność PCR • Glikol poletylenowy (PEG) został także skutecznie zastosowany dla efektywniejszej amplifikacji DNA. Najbardziej skuteczne stężenie określono w zakresie 5 do 15%. Efektywność maleje przy wysokich stężeniach przekraczających 20%. • Niejonowy detergent Tween 20 stosuje się często w przypadku gdy istnieją podejrzenia zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej przez jonowy detergent SDS (np. pochodzący z izolacji DNA metodą stosującą do lizy SDS). Tween 20 znosi hamujący efekt pewnych jonowych detergentów.

31. Dodatkowe składniki wpływające na efektywność PCR Podsumowując: • składniki dodatkowe dodane racjonalnie do mieszaniny reakcyjnej mogą znacznie polepszyć efektywność, czułość i specyficzność reakcji PCR, wpływając na różne parametry reakcji; • trudno jest jednoznacznie określić jaki jest dokładnie mechanizm polepszania efektywności reakcji PCR przez te czynniki (przypuszczalnie jest on sumą efektów zachodzących w każdym cyklu reakcji poprzez wpływ na denaturację matryc, hybrydyzację primerów i aktywność polimerazy Taq).