Dr. Juan Pablo Damián Área de Bioquímica Facultad de Veterinaria, Montevideo, Uruguay. UdelaR

1. Ciclo de Krebs (Ciclo del ácido cítrico) Dr. Juan Pablo Damián Área de Bioquímica Facultad de Veterinaria, Montevideo, Uruguay. UdelaR

2. Hans Adolf Krebs En 1932, se traslada a la Universidad de Friburgo, y en conjunto con el bioquímico Kurt Henseleit, descubre las reacciones involucradas en el ciclo de la úrea Alemania Inglaterra Urea synthesis in mammalian liver [5], Krebs, H.A. 1943 . Nature 151 (3818), pp. 23

3. Premio Nobel de Fisiología y Medicina, 1953 Krebs y Lipmann Compuestos ricos en enegría

4. THE INTERMEDIATE METABOLISM OF CARBOHYDRATES Krebs, H.A. 1937 The Lancet 230 (5952), pp. 736-738 Citedby

5. Objetivos: • Comprender la importancia del Ciclo de Krebs en el metabolismo. • Conocer las reacciones del Ciclo de Krebs y su regulación. 1) Introducción - Fuentes de acetato. - Ubicación del ciclo en el mapa metabólico y en la célula. - Condiciones energéticas 2)Reacciones del ciclo 3) Balance global 4) Regulación 5) Funciones anabólicas 6) Reacciones anapleróticas

6. Ubicación del Ciclo de Krebs en la respiración celular 1) Producción de Acetil-CoA 2) Oxidación de Acetil-CoA 3) Transferencia e- y fosforilación oxidativa Modificado Fig. 16-1 de Lehninger

7. O CH3-C-S-CoA ¿En que ruta se oxida Acetil-CoA? Ciclo de Krebs (ciclo del ácido cítrico) es una ruta cíclica constituida por una secuencia de 8 reacciones. La entrada de casi todos los “combustible” al Ciclo de Krebs es como Acetil-CoA (grupo acetilo activado). Acetil-CoA:

8. O CH3-C-S-CoA que es el Acetil-CoA? • producto de la degradación de los carbohidratos, lípidos y aminoácidos. • 2) compuesto de “alta energía”, ∆G’o = -31.5 kJ/mol (hidrólisis del enlace tioester, más exergónica que la del ATP que es -30.5 KJ/mol). • 3) Es el principal combustible del ciclo de Krebs.

9. ¿Donde se realiza el ciclo de Krebs? Es en la mitocondria donde se realizan todas las reacciones del Ciclo de Krebs Lehninger (1917-1986)

10. Fases o Etapas de la respiración Aas tb´dan Piruvato? Mitocondria

11. Ciclo de Krebs Aas tb´dan Piruvato? Ciclo de Krebs (ciclo del ácido cítrico): es una ruta cíclica constituida por una secuencia de 8 reacciones, mediante el cual se oxida el AcetilCoA y se conserva la energía de oxidación en forma de coenzimas reducidos.

12. Membrana externa Membrana externa Membrana externa Cara externa Cara interna Citosol Membrana interna Membrana interna Membrana interna Cara externa Crestas Cara interna Matriz Matriz Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa Enzimas del Ciclo de Krebs (7 matriz y 1 membrana interna) Ciclo de Krebs Localización: mitocondria 1948 - Kennedy & Lehninger; Todaslasreacciones del ciclo de Krebs se ubican en la mitocondria Donde se producen la mayor parte de las reacciones oxidativas que liberan energía y se acoplan a la síntesis de ATP. Lehninger (1917-1986) AG a AcetilCoA Degradación Ox de aas Cte- y FOx

13. Membrana externa mitocondria Membrana interna Matriz

14. Es en la mitocondria donde se realizan todas las reacciones del Ciclo de Krebs EN LA MITOCONDRIA, ¿DONDE SE LOCALIZAN LAS ENZIMAS DEL CICLO DE KREBS? Lehninger (1917-1986) 1948 - Kennedy & Lehninger 1 en membrana mitocondrial interna 7 en matriz mitocondrial Complejo Piruvato Deshidrogena también en matriz mitocondrial

15. Reaccionesdel Ciclo de Krebs

16. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 8 NADH 3 7 FADH2 4 6 GTP 5 CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- H COO- Deshidrogenación H CH2 COO- Isomerización CH H COO- COO- C COO- HO C ―H HO H Descarboxilación Oxidativa HC ―H CO2 COO- CH2 COO- Fosforilación a nivel de sustrato Hidratación CH2 COO- COO- C COO- CH COO- CH2 O CH Descarboxilación oxidativa CH2 CH2 COO- CH2 C SCoA Deshidrogenación COO- O CO2

17. Condensación CoA-SH H2O O C COO- CH2 COO- Unión al OA Acetil CoA S-CoA CH3 C O O Citrato sintasa CH2 C Oxalacetato O- Citrato 1 C HO COO- Grupo carbonílico C2 CH2 COO- ∆G’o = -32.2 kJ/mol Enzima homodiméricacada subunidad tiene 2 dominios, Grande y rígido Y otro pequeño y flexible, el sitio activo se sitúa entre los dos. Forma abierta Forma cerrada

18. Citrato sintasa: se cristalizo y se dedujo su estructura por difracción con rayos X Forma cerrada Forma abierta 1er sustrato Cada subunidad: dos dominios 1 rígido y otro mas pequeño flexible, SA situado entre los dos Unión de OA induce cambio conformación en el flexible, aparición de sitio de unión para Acetil coA

19. El oxalacetato, primer sustrato que se une al enzima, induce un cambio conformacional en el dominio flexible, que provoca la aparición de un sitio de unión para el segundo sustrato, el acetil-CoA. El AcetilCoA al perder o ceder un protón al Asp 375 se Convierte en un intermediario enolato, este interm. se estabiliza por formación de puentes de hidrógeno con la His274. El enolato se reordena para atacar el carbono carbonílico del oxalacetato, la Hist 320 actúa como Un ácido gral. La condensación restante genera citril-CoA Se forma “citril-CoA” (intermediario) cuya hidrolisis hace que la reacción sea muy exergonica. El tioéster se hidroliza a continuación, regenerando CoA-SH y produciendo citrato.

20. flechas=movimiento de e- 3 cadenas laterales se orientan p/catalisis unión tioéster del Acetil-CoA activa los H metilicos y Asp capta protón del grupo metilo dando un intermediario Enolato estabilizado por puentes de H y/o protonización de His El enolato se reordena y ataca el C carbonilo del oxalacetato con la His en posición de captar el protón que había cedido (His actúa como un ácido general) La condensación resultante genera citril CoA

21. Hidrólisis del tioéster regenerando CoA-SH y dando citrato

22. CoA-SH H2O O C COO- CH2 COO- Unión al OA Acetil CoA S-CoA CH3 C O O Citrato sintasa CH2 C Oxalacetato (OA) O- Citrato 1 C HO COO- CH2 COO- ∆G’o = -32.2 kJ/mol Unión de OA induce cambio conformacional, provoca aparición del sitio de unión para acetil-CoA. Se forma “citril-CoA” (intermediario) cuya hidrolisis hace que la reaccion sea muy exergonica. Reacción fundamental para el funcionamiento global del ciclo debido a la baja concentración de oxalacetato (<10-6M). 1) Condensación de OA (4 C) y acetil-CoA (2 C) para dar citrato (6 C).

23. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- H COO- H CH2 COO- Isomerización CH H COO- Aconitasa (aconitato hidratasa) C COO- HO H Isocitrato

24. Isomerización 2 H2O O CH2 COO- CH2 C CH2 COO- O- CH C C H COO- COO- COO- HO C COO- HO C COO- C COO- H aconitasa aconitasa H H H Isocitrato Citrato cis-Aconitato ∆G’o = 13.3 kJ/mol La aconitasa hidratasa cataliza la transformación reversible del citrato en isocitrato a través de la formación intermedia de ác tricarboxílico cis-aconitato. Que normalmente no se disocia del centro activo Aconitasa cambia OH del C2 al C3 (se forma el intermediario “Cis-aconitato”que no se desprende de la enzima). En la célula la reacción transcurre a la derecha gracias a la rapidez del consumo de isocitrato en el siguiente paso del ciclo, entonces disminuye su concentración

25. Isomerización 2 H2O O CH2 COO- CH2 C CH2 COO- O- CH C C H COO- COO- COO- HO C COO- HO C COO- C COO- H aconitasa aconitasa H H H Isocitrato Citrato cis-Aconitato ∆G’o = 13.3 kJ/mol La aconitasa contiene un Centro ferro-sulfurado que actúa como centro de fijación de sustratos en el centro activo, catalítico y como en la adición o eliminación de agua.

26. Aconitasa Centro ferro-sulfurado Residuo básico de E colabora (posiciona Citrato en sitio activo) 3 Residuos de Cys unidos a Fe, 1 al carboxilo (también interactúa con OH) del citrato carencia de F: pierde centro ferro-sulfurado

27. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 NADH 3 CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- H COO- H CH2 COO- Isomerización CH H COO- C COO- HO Isocitrato H NAD+ CO2 Descarboxilación Oxidativa CH2 COO- Isocitrato deshidrogenasa CH2 C COO- 3) Descarboxilacion oxidativa O α-cetoglutarato se oxida el isocitrato y se reduce el NAD+, un grupo carboxilo sale como CO2.

28. 3. Oxidación del isocitrato a a-cetoglutarato y CO2 eliminación de e- por Mn2+ unido facilita descarboxilación Descarboxilación oxidativa del isocitrato NADH+ H+ CO2 intermediario enol NAD+ CH2 COO- CH2 CH2 CH2 COO- COO- COO- H+ CH C C C H COO- H H H H COO- H 1 2 3 C HO O- O- C O C C Mn2+ Mn2+ C C C C O- O- O- O- O O O O a-cetoglutarato Isocitrato Oxalosuccinato Isocitrato se oxida a través de la transferencia de un hidruro al NAD+ ∆G’o = -20,9 kJ/mol Reordenamiento del intermediario enol genera α-cetoglutarato Oxidación Transferencia de Ion hidruro Isocitrato deshigrogenasa Eliminación de e- por Mn2+ unido facilita descarboxilación Reordenamiento del intermediario enol genera α-cetoglutarato Existen dos formas diferentes de isocitrato deshidrogenasa: • NAD dependiente (matriz mitocondrial) • NADP dependiente (matriz mitocondrial y citosol)

29. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 NADH 3 CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- H COO- H CH2 COO- Isomerización CH H COO- C COO- HO Isocitrato H Descarboxilación Oxidativa CO2 NAD+ CH2 COO- CH2 COO- COO- C COO- 4 CH2 CH2 O α-cetoglutarato CH2 CH2 CO2 NAD+ CoA-SH C C SCoA SCoA Succinil-CoA O O

30. 4. Oxidación de a-cetoglutarato a succinil-CoA y CO2 Descarboxilación oxidativa del a-cetoglutarato NADH+ H+ CoA-SH NAD+ CH2 COO- CH2 COO- C H H C H H CO2 + O- C S-CoA C C O- O O ∆G’o = -33.5 kJ/mol Succinil-CoA a-cetoglutarato Complejo multienzimático de la “α-cetoglutarato deshidrogenasa” Posee 3 enzimas homólogos a (E1, E2, E3) de la piruvato desh 5 Cofactores (TPP, lipoato, FAD, CoA y NAD) Paso 4: Descarboxilación oxidativa El complejo de la α-cetoglutarato deshidrogenasa es muy parecido al complejo piruvato deshidrogenasa, tanto en estructura como en función

31. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 NADH 3 GTP CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- H COO- H CH2 COO- Isomerización CH H COO- C COO- HO Isocitrato H Descarboxilación Oxidativa CO2 NAD+ CH2 COO- Fosforilación a nivel de sustrato CH2 COO- COO- C COO- COO- 4 CH2 CH2 O α-cetoglutarato CH2 CH2 CH2 CO2 Succinil-CoA sintetasa 5 NAD+ CoA-SH CH2 C C SCoA SCoA Succinato COO- Succinil-CoA GDP O O

32. 5. Conversión del Succinil-CoA e Succinato Fosforilación a nivel de sustrato CoA-SH GDP + Pi GTP CH2 COO- COO- C H H C H H S-CoA C H2 C O COO- ∆G’o = -2,9 kJ/mol Succinil-CoA Succinato Succinil-CoA sintetasa La formación acoplada de GTP (o ATP) a expensas de la energía liberada por la decarboxilación oxidativa del α-ceto ceto-glutarato glutarato es otro ejemplo de fosforilación a nivel del sustrato

33. 5. Conversión del Succinil-CoA en Succinato CoA-SH GDP + Pi GTP CH2 COO- COO- C H H C H H S-CoA C H2 C O COO- ∆G’o = -2,9 kJ/mol Succinil-CoA Succinato Succinil-CoA sintetasa El succinil-CoA tiene un enlace tioéster con una energía libre de estándar de Hidrólisis que es altamente negativa (∆G’o = -36 kJ/mol). La energía liberada en La rotura de este enlace se utiliza para promover la síntesis de un enlace Fosfoanhídrido del GTP o del ATP con una variación neta de ∆G’o = -2,9 kJ/mol La formación acoplada de GTP (o ATP) a expensas de la energía liberada por la decarboxilación oxidativa del α-ceto ceto-glutarato glutarato es otro ejemplo de fosforilación a nivel del sustrato

34. Succinil-CoA sintetasa • En tres pasos: • El sucinil-CoA se une al enzima, y un grupo fosforilo • sustituye al CoA del succinil-CoA, y se forma un acil fosfato de alta energía. • El succinil fosfato dona el grupo fosforilo a un residuo de His del enzima, y se forma un fosfohistidil enzima de elevada energía • El grupo fosforilo es transferido desde el res His al fosfato terminal de GDP formando GTP.

35. Nucleosido difosfatasa quinasa GTP + ADP GDP + ATP ΔG´°= 0 kJ/mo 5. Conversión del Succinil-CoA e Succinato Fosforilación a nivel de sustrato CoA-SH GDP + Pi GTP CH2 COO- COO- C H H C H H S-CoA C H2 C O COO- ∆G’o = -2,9 kJ/mol Succinil-CoA Succinato Succinil-CoA sintetasa

36. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 NADH 3 FADH2 GTP CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- H COO- H CH2 COO- Isomerización CH H COO- C COO- HO Isocitrato H Succinato deshidrogenasa Descarboxilación Oxidativa membrana mitocondrial interna CO2 6) Oxido-reducción. NAD+ CH2 COO- Fosforilación a nivel de sustrato CH2 COO- COO- COO- C COO- CH COO- 4 CH2 CH2 O α-cetoglutarato CH 6 CH2 CH2 CH2 Fumarato CO2 COO- 5 NAD+ CoA-SH CH2 C C SCoA SCoA Succinato COO- Succinil-CoA GDP O O

37. 6. Oxidación del Succinato a Fumarato FAD FADH2 COO- COO- C H C H2 C H2 C Succinato deshidrogenasa H COO- COO- Succinato Fumarato ∆G’o = 0 kJ/mol En eucariotas, la succinato deshidrogenasa se encuentra unida a la membrana mitocondrial interna, contiene tres centros hierro-azufre diferentes y una molécula de FAD unida covalentemente.

38. 6. Oxidación del Succinato a Fumarato FAD FADH2 COO- COO- C H C H2 C H2 C H Succinato deshidrogenasa COO- COO- Succinato Fumarato ∆G’o = 0 kJ/mol Membrana externa Cara externa Cara interna Citosol En eucariotas, la succinato deshidrogenasa se encuentra unida a la membrana mitocondrial interna, contiene tres centros hierro-azufre diferentes y una molécula de FAD unida covalentemente. Cara externa Cara interna Matriz

39. O O Succinato FAD C CH2 CH2 C QH2 O O- O O Fumarato FADH2 Q C CH CH C O O- Complejo II: Succinato Deshidrogenasa Ciclo de Krebs

40. O O Succinato FAD C CH2 CH2 C QH2 O O- O O Fumarato FADH2 Q C CH CH C O O- Complejo II: Succinato Deshidrogenasa FADH2+ Q  FAD + QH2 Succinato Fumarato ΔG´°= -16,4 Kj/mol

41. 6. Oxidación del Succinato a Fumarato FAD FADH2 CH2 COO- COO- C H C H2 C H2 C Succinato deshidrogenasa H COO- COO- Succinato Fumarato En eucariotas, la succinato deshidrogenasa se encuentra unida a la membrana mitocondrial interna, contiene tres centros hierro-azufre diferentes y una molécula de FAD unida covalentemente.

42. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 COO- Malonato (análogo succinato) CH2 COO- NADH 3 FADH2 GTP CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- H COO- H CH2 COO- Isomerización CH H COO- C COO- HO inhibidor competitivo Isocitrato H Succinato deshidrogenasa Descarboxilación Oxidativa CO2 NAD+ CH2 COO- Fosforilación a nivel de sustrato CH2 COO- COO- COO- C COO- CH COO- 4 CH2 CH2 O α-cetoglutarato CH 6 CH2 CH2 CH2 Fumarato CO2 COO- 5 NAD+ CoA-SH CH2 C C SCoA SCoA Succinato COO- Succinil-CoA GDP O O

43. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 NADH 3 FADH2 GTP CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- H COO- H CH2 COO- Fumarasa (fumarato hidratasa), estereoespecífica Isomerización CH H COO- COO- C COO- HO Isocitrato C ―H HO H HC ―H L-Malato Descarboxilación Oxidativa CO2 COO- NAD+ CH2 7 COO- Fosforilación a nivel de sustrato Hidratación CH2 COO- COO- COO- C COO- CH COO- 4 CH2 CH2 O α-cetoglutarato CH 6 CH2 CH2 CH2 Fumarato CO2 COO- 5 NAD+ CoA-SH CH2 C C SCoA SCoA Succinato COO- Succinil-CoA GDP O O

44. 7. Hidratación del Fumarato a Malato. COO- COO- H2O C H C H HO C C H H H Fumarasa COO- COO- Fumarato L-Malato ∆G’o = -3,8 kJ/mol Cataliza la hidratación del doble enlace en trans del fumarato Esta enzima es específica para el fumarato y el L-malato

45. Cis Trans

46. 7. Hidratación del Fumarato a Malato. COO- COO- H2O C H C H HO C C H H H Fumarasa COO- COO- Fumarato L-Malato ∆G’o = -3,8 kJ/mol COO- COO- COO- OH- H+ C H C H HO C H HO C C H H H C H Fumarasa COO- COO- COO- Fumarato L-Malato Estado de transición carbanión Esta enzima es específica para el fumarato y el L-malato

47. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 NADH 3 FADH2 GTP CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- NAD+ H COO- H CH2 COO- Deshidrogenación Isomerización 8 CH H COO- COO- C COO- HO Isocitrato C ―H HO H HC ―H L-Malato Descarboxilación Oxidativa CO2 COO- NAD+ CH2 7 COO- Fosforilación a nivel de sustrato Hidratación CH2 COO- COO- COO- C COO- CH COO- 4 CH2 CH2 O α-cetoglutarato CH 6 CH2 CH2 CH2 Fumarato CO2 COO- 5 NAD+ CoA-SH CH2 C C SCoA SCoA Succinato COO- Succinil-CoA GDP O O

48. 8. Oxidación del malato a oxalacetato NADH+ H+ NAD+ COO- COO- C O C H HO C H H C H H COO- COO- L- Malato deshidrogenasa Oxalacetato L-Malato ∆G’o = 29,7 kJ/mol El Oxalacetato es eliminado continuamente por la reacción altamente exergónica de la citrato sintasa. Esto mantiene la concentración de oxalacetato relativamente baja <106M, lo que empuja la reacción de la malato deshidrogenasa hacia la formación de oxalacetato 1 sola molécula de Oxalacetato es usada para catalizar un gran número de Acetil CoA

49. Panorámica del ciclo de Krebs 1 2 NADH 3 FADH2 GTP CH3 C SCoA Acetil CoA O COO- O CH2 C O C O- C Citrato HO COO- Condensación oxalacetato CH2 C COO- NAD+ ∆G’o = -32.2 kJ/mol H COO- H CH2 COO- Deshidrogenación Isomerización 8 ∆G’o = 29,7 kJ/mol CH H COO- COO- C COO- HO • equilibrio de reacción desplazado a la formación de malato • [oxalacetato] (<10-6M) si es utilizado continuamente (citrato sintasa) • empuja la reacción a la formación de oxalacetato Isocitrato C ―H HO H HC ―H L-Malato Descarboxilación Oxidativa CO2 COO- NAD+ CH2 7 COO- Fosforilación a nivel de sustrato Hidratación CH2 COO- COO- COO- C COO- CH COO- 4 CH2 CH2 O α-cetoglutarato CH 6 CH2 CH2 CH2 Fumarato CO2 COO- 5 NAD+ CoA-SH CH2 C C SCoA SCoA Succinato COO- Succinil-CoA GDP O O