Flow cytometrie bij lage cytoses in lumbaal vocht

1. Flow cytometrie bij lage cytoses in lumbaal vocht Veerle CompernolleSupervisor: Nancy Boeckx

2. Principe van Flow Cytometrie Stream of fluid containing antibody-labeled cells Fluorescencedetectors Side scatter Laser Forward scatter

3. Onderwerp van critical appraised topic = Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op cerebrospinaal vocht

4. Onderwerp van critical appraised topic = Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op vochten Identificatie van een receptor of een membraan- of cytoplasma- ofnucleair antigeen van hematopoïetische cellen, exclusief de antigenen van het HLA systeem Beperking: De verstrekkingen 555730-555741 en 555752-555763 mogen enkel worden aangerekend aan de ZIV voor het typeren van hematologische maligniteiten, of in geval van congenitale of levensbedreigende verworven immunodeficiënties, of in geval van sarcoïdose.

5. Onderwerp van critical appraised topic = Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op vochten Voornamelijk: Opsporen metastasen van hematologische maligniteiten in cerebrospinaal vocht

6. Klinische gegevens bij aanvraag

7. Belang opsporen hematologische metastasen in cerebrospinaal vocht • Prognostisch • Intensificatie van de therapie Intrathecale chemotherapie & Radiotherapie Nevenwerkingen: oa. -secundaire maligniteiten -verminderde cognitieve capaciteit -groeiretardatie...

8. Laboratory and imaging findings in patients with leptomenigeal carcinomatosis (ref. Grossman et al. Cancer treatment reviews, 1999: 25:103-119) Diagnostic test Abnormal finding % of patients with abnormal findings Lumbar puncture Elevated CSF protein Elevated CSF pressure Low CSF glucose Positive CSF cytology on initial lumbar puncture Positive CSF cytology after three lumbar punctures 75% 50% 40% 50% 85% Neuro-imaging studies Abnormal findings 50%

9. Laboratory and imaging findings in patients with leptomenigeal carcinomatosis (ref. Grossman et al. Cancer treatment reviews, 1999: 25:103-119) Diagnostic test Abnormal finding % of patients with abnormal findings Lumbar puncture Elevated CSF protein Elevated CSF pressure Low CSF glucose Positive CSF cytology on initial lumbar puncture Positive CSF cytology after three lumbar punctures 75% 50% 40% 50% 85% Goudenstandaard Neuro-imaging studies Abnormal findings 50%

10. Goudenstandaard: cytologie • Sensitiviteit: 50-70% • Goede specificiteit 1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde? -het aantal vals negatieve resultaten verminderen? -Quid specificiteit? 2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal

11. Overzicht van uitgevoerde en geannuleerde stalen(2002-2003) (cellen/µl)

12. Vragen 1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde? -het aantal vals negatieve resultaten verminderen? -Quid specificiteit? 2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal 3. Zijn deze annulaties terecht? Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

13. 1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?

14. Guidelines: “Flow cytometrische immunofenotypering van cerebrospinaal vocht kan klinisch nuttig zijn bij patiënten met een vermoeden van maligne lymfomen of leukemie”

15. Validiteit studies Fernandez Urbanits Moriarty French Valdez Subira Roma Finn Geen Cytologie Referentietest Nee Ja Ja ? Ja Klinische F.U. nvt ? Ja ? Referentietest Onafh+blind? Nee 2xniet nvt ? Ja Ja 2x niet Referentietest steeds uitgevoerd? ? CNSinvasie? ? Ja CNSinvasie? Test onafh. van andere infouitgevoerd Ja Validatie in 2° onafh groep? Nee

16. Patiëntenspectrum

17. Fernan-dez Urbanits French Subira Roma Finn Aantal patiënten 43 31 51 18 32 Aantal CSV-stalen 53 168 352 36 31 35 -totaal -Valide cyto+IF 51 168 291 25 27 23 -Concordante 4078% 158 94% 283 97% 17 68% 19 70% 13 69% negatief 28 147 269 11 14 9 12 11 14 6 5 4 positief -Discordante 11 9 8 5 8 3 Cyto+/IF- 2 3 1 * + 1 * • + 1 1 1 Cyto-/IF+ 9 6 2 * + 1 * 3 7 2 3 6 -Onduidelijk 1 Cyto?/IF- 3 5 Cyto-/IF? 1 1

18. Aantal stalen Sensitiviteit Specificiteit Prevalentie Cyto IF Cyto IF Roma et al. 0,412 51 0,57 1,00 0,93 1,00 Subira et al. 0,102 167 0,65 1,00 0,98 1,00 Urbanits et al. 0,485 27 0,46 0,92 1,00 1,00 Sensitiviteit/specificiteit werd berekend -met ‘klinische follow-up’ als gouden standaard -met gebruik van aantal stalen

22. Resultaten 2002-2003 77%

23. Concordante en discordante resultaten in functie van de cytose (cellen/µl)

24. 1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde? Besluit • Er is een grote concordantie tussen immunofenotypering en cytologisch onderzoek • Combinatie van immunofenotypering en cytologisch onderzoek kan het aantal vals negatieve resultaten verminderen. • De specificiteit van immunofenotypering dmv flow cytometrie is zeer goed

25. Houding t.o.v. discordante resultaten? Quid: Negatief (of twijfelachtig) resultaat bij cytologie en positieve immunofenotypering • Hematologie: Beschouwen als positief resultaat. Aanpassen therapie • Pediatrische hemato-oncologie: geen aanpassing therapie.

26. 2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal? - Geen anticoagulans; geen fixatie OK - Onmiddelijk transport naar labo - Beschikbare klinische of diagnostische informatie moet samen met het staal opgestuurd worden - Bewaring op kamertemperatuur OK - Analyse binnen de : -3 uur (Subira) -8 uur (Australasian group) -24 uur (Finn) Stalen worden soms pas na 24 uur geanalyseerd!

27. 2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal? • -Lysis van erythrocyten door externe lyserende reagentia • is aanvaardbaar • Globaal voor immunofenotypering: • Idealiter: 500000-1000000 cellen per tube. Bij cytose van 50 cellen/µl: 10 ml nodig !!!Ideale aantal cellen wordt dus zelden gehaald.

28. 3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol? Guidelines -“There is a strong consensus among all conference participants that every attempt should be made to derive useful information from any specimen submitted for analysis.” -Flagging criteria intrinsiek aan staal: hypocellulariteit (US-Canadian Consensus)

29. 3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol? -Welke verwerpingscriteria worden gehanteerdin originele studies? -Is het detecteren van zeer kleine aantallen blasten/lymfoomcellen zinvol?

31. Resultaat immunofenotyperingen bij lymfomen in functie van de cytose (cellen/µl)

32. Resultaat immunofenotyperingen bij leukemie in functie van de cytose (cellen/µl)

33. Is het opsporen van kleine aberrante populaties zinvol ? Leukemie • CNS leukemie wordt meestal gedefiniëerd als de aanwezigheid van leukemische blasten (na cytocentrifugatie) in cerebrospinale vochten met meer dan 5 leukocyten per microliter. • Klinisch belang van blasten bij cytose<5/µl is onduidelijk.

34. Gilchrist et al.: geen verhoogd risico voor CNS-relapse of andere relapse dan CNS-negative patiënten. (ALL) Tubergen et al. : De ‘disease free survival’ is na 5 jaar niet verschillend. Bürger et al.: goede prognose en hebben geen intensificatie van CNS-gerichte therapie nodig. (ALL)Abott et al.: geen prognostisch belang. (AML) Mahmoud et al.: een verhoogd risico op relapse en hebben mogelijks een meer intensieve intrathecale therapie nodig. (ALL) CAVE: Sommige studies (oa Bürger et al. ,Abott et al.) patiënten met blasten in cerebrospinaal vocht met normale cytose, een meer intensieve behandeling kregen dan patiëntenzonder blasten in het cerebrospinaal vocht.

35. Houding kliniek t.o.v. blasten bij lage cytose? • Zowel op hematologie als op pediatrische hemato-oncologie wordt er weinig onderscheid gemaakt tussen: • Blasten aanwezig in CSV met een cytose onder de 5/µl EN • Blasten in CSV met cytose boven de 5/µl.

36. Lymfomen • Belang van detectie van zeer kleine populaties onduidelijk

37. 3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol? Besluit • Ook bij een gering aantal cellen zullen soms maligniteiten kunnen gediagnosticeerd worden • Bij minder dan 10000 cellen zullen sommige analyse resultaten niet meer betrouwbaar kunnen geïnterpreteerd worden • Op basis van klinische praktijk in UZ: onvoldoende argumenten om stalen onder een bepaalde cytose te annuleren.

38. TO DO • Indien een staal minder dan10000 cellen bevat: enkel immunofenotypering uitvoeren indien diagnostisch fenotype van lymfoom/leukemie gekend is. • Indien na analyse blijkt dat er minder dan200 events hebben plaatsgevonden in de diagnostische populatie: “te weinig events aanwezig voor betrouwbare analyse” aan protocol toevoegen • Bij toekomstige stalen: nagaan met hoeveel events ‘10000 cellen’ overeenkomt

39. TO DO Nu: voor B-cell lymphoma: minstens 2 panels van antistoffen, nl: CD45/CD19/kappa lichte keten CD45/CD19/lambda lichte keten Investigeren of we kunnen overschakelen naar 1 panel, nl: CD19/kappa lichte keten/lambda lichte keten (drie-kleuren analyse) CD45/CD19/kappa lichte keten/lambda lichte keten (vier-kleuren analyse)

40. TO DO • Op stalen die ouder zijn dan 24 uur: geen immunofenotypering meer uitvoeren. • Stalen die voor 15u00 op het laboratorium toekomen nog dezelfde dag analyseren.

41. TO DO • Aanpassen op intranet: • Aanpassen afname-instructies: • Minimum 2 ml cerebrospinaal vocht opvangen in een steriel buis met schroefdop. • Op vrijdag moet staal voor 12 uur op laboratorium toekomen • Aanpassen uitvoeringsfrequentie: • Geen Immunofenotyp. Diagn & MRD in cerebrospinaalvocht tijdens het week-end.