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Estudo do complemento

Estudo do complemento. O sistema do complemento. Testes funcionais do complemento (I). CH50 Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro sensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneiro

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Presentation Transcript

  1. Estudo do complemento Prof.Doutor José Cabeda

  2. O sistema do complemento Prof. Doutor José Cabeda

  3. Testes funcionais do complemento (I) • CH50 • Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro sensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneiro • Diluições seriadas de soro teste são misturados com igual volume dos eritrócitos sensibilizados e incubados a 37ºC • A reacção é parada com PBS frio • A lise é estimada pela [hemoglobina] por espectrofotometria • Comparação com 0% de lise (sem soro) e 100% lise (por acção de água pura). • Actividade do complemento dada pela diluição necessária para obter 50% de lise. Resultado expresso pelo inverso desta diluição em unidades de CH50/mL soro. • Resultado baixo pode significar deficiência ou consumo • Heterozigotos têm habitualmente valores normais-baixos de CH50 Prof. Doutor José Cabeda

  4. Testes funcionais do complemento (II) • AH50 • Semelhante ao CH50, por se basear na quantificação da lise de eritrócitos • Baseia-se no facto de a via alterna ser activada por e provocar a lise de eritrócitos de coelho • Activação da via clássica inibida por quelatação do Ca2+ com EGTA • A maior parte das deficiências de C3 por consumo são devidas à activação da via alterna, devido ao ciclo de amplificação do C3 Prof. Doutor José Cabeda

  5. Testes funcionais do complemento (III) • Outros • ELISA • Detecção do componente terminal da cascata de activação clássica • C5b-6-7-8-9 • Medida de lise de liposomas contendo enzimas • Utiliza processos automáticos de quimica clínica Prof. Doutor José Cabeda

  6. Testes funcionais do complemento (IV) • Testes funcionais para componentes do complemento • Fazer CH50 ou AH50 com • Complementação por soros deficientes num componente • Complementação com componentes puros Prof. Doutor José Cabeda

  7. Testes quantitativos do complemento • Quantificação de proteínas do complemento • Identificação das deficiências • Quantificação de produtos de hidrólise do complemento • Diferenciação entre deficiência e consumo • C4a/C4 ou C4d/C4=> via clássica • Bb => via alterna • C3a e C5a => via final (mas têm curtas semi-vidas, pelo que a Protein S é uma melhor alternativa) • Nefelometria Prof. Doutor José Cabeda

  8. Prof. Doutor José Cabeda

  9. Colheitas • Má colheita => deficiência de complemento • Evitar >2 ciclos de congelação/descongelação • Soro com crioglobulinas tem que ser testado de imediato • Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar coagular (30 min a 37ºC ou 60 a RT), centrifugar e guardar a –70ºC • Tempo excessivo de espera origina deficiência (as proteases celulares degradam as proteínas do complemento) • Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias e particulas activam o complemento in vitro provocando falsa deficiência • Hemólise interfere na leitura Prof. Doutor José Cabeda

  10. Análise Genética do C4 Prof.Doutor José Cabeda

  11. O Gene do C4 localiza-se no MHC-III Prof. Doutor José Cabeda

  12. O gene do C4 • dois genes: • C4A (ácido) • C4B (básico) • 6p21.3 • 41 exões • intrão 9 tem 7 Kb • Se intrão 7 presente o gene tem 21 Kb • Se intrão 7 ausente o gene tem 16 Kb. Prof. Doutor José Cabeda

  13. Os Módulos RCCX • Módulo RCCX • RP1 • C4 • CYP21 • Tenascin X • Normalmente 2 módulos em tandem • RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB Prof. Doutor José Cabeda

  14. Os alelos C4A e C4B • C4B • o aminoácido nucleofílico (His) ataca o grupo tiol de um resíduo de cisteína, formando um intermediário acídico • C4A • a asparagina, não sendo nucleofílica não origina a formação do intermediário pelo que a reacção de ligação ás outras moléculas é mais lenta Prof. Doutor José Cabeda

  15. TaqI - RFLP (quantificação dos elementos RCCX) Prof. Doutor José Cabeda

  16. Taq I e pshA I RFLP Prof. Doutor José Cabeda

  17. Imunofixação de C4A e C4B Prof. Doutor José Cabeda

  18. Prof. Doutor José Cabeda

  19. Determinação de fenótipo C4 Prof. Doutor José Cabeda

  20. PFGE para genotipagem C4 • M S => 75Kb; L => 85Kb • B LS => 105Kb; LL => 115 Kb • T • LSS => 135 Kb • LLS => 140 Kb • LLL => 150 Kb Prof. Doutor José Cabeda

  21. Número de módulos RCCX RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB Prof. Doutor José Cabeda

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