Ellenanyag reagensek előállítása 2019.02.25. Sándor Noémi noemi.sandor @ ttk.elte.hu

1. Ellenanyag reagensek előállítása 2019.02.25. Sándor Noéminoemi.sandor@ttk.elte.hu

2. 2. Antigének, immunizálás fejezet (29-31.oldal, 38-41. oldal) 3. Ellenanyagok fejezet (43-45. oldal, 47-50. oldal, 56-65. oldal, 73-75. oldal, 87. oldal) 2. Patogének, antigének, haptének (41-46. oldal) 11. A limfociták antigén-felismerő receptorának kialakulása (276-284. oldal) 14. A humorális immunválasz

3. Mire használjuk az ellenanyagokat? Ugyanarra, amire a természet → specifikusan kapcsolódjon a célponthoz (antigénhez) Az ellenanyag jelen esetben „eszköz” (de van hogy az ellenanyagot detektáljuk, pl. diagnosztika, oltás sikerességének ellenőrzése!) A számunkra érdekes molekula (=antigén) kimutatása, tisztítása, jelölése stb. specifikusanAntigén-ellenanyag kapcsolat nagyon erős (=nagy affinitású)Nagyon kevés vizsgálandó anyag is kimutatható, azonosítható a mintában.

4. Hogyan is néz ki egy ellenanyag? Nehéz lánc Antigén felismerés(variábilis részek által) Könnyű lánc Fab V=variábilis C=konstans Fc Effektor funckiók(Fc receptorhoz kötődés, komplement aktiválás)

5. Az antigén felismerés Antigénen felismert szakaszok = antigén determinánsok vagy epitópok Erdei, Immunológia

6. Hogyan alakul ki az ellenanyag válasz? 3. 1. 2. 107-109 féle Erdei, Immunológia Az antigén felismerése az arra specifikus B-sejt receptort (BCR) hordozó limfociták által A specifikus, kiválasztott sejtek aktiválódnak és osztódnak (klonális= az utód sejtek az eredetileg aktiválódó sejttel megegyezőek) Ellenanyag termelés

7. Hogyan alakul ki a BCR repertoár? RAG és TdTenzimek végzik Erdei, Immunológia

8. Hogyan alakul ki a BCR repertoár? • A sokféleségért (felismerés) felelős tényezők • Az B-sejtek érése során • - a V, a D és a J génszegmensek száma • - a kapcsolódási kombinációk • - pontatlan átrendeződések • extra nukleotid beépülések • H – L kapcsolódás

9. Hogyan alakul ki az ellenanyag válasz? 3. 1. 2. 107-109 féle Erdei, Immunológia Az antigén felismerése az arra specifikus B-sejt receptort (BCR) hordozó limfociták által A specifikus, kiválasztott sejtek aktiválódnak és osztódnak (klonális= az utód sejtek az eredetileg aktiválódó sejttel megegyezőek) Ellenanyag termelés

10. Hogyan változik az ellenanyag az immunválasz során? • Az B-sejtek aktivációja során • - a szomatikus hipermutációk (antigén kötő képesség változik) • Izotípus váltás (effektor funkciók változnak)IgM → IgG/E/A Abbas, 2012

11. Az antigén-ellenanyag kapcsolódás jellemzői - alapfogalmak • Az ellenanyag affinitása: • (disszociációs konstans, Kd): • ag koncentráció, ami az ag-kötőhelyek felét telíti: • 10-7 – 10-11 M/liter • Az ellenanyag aviditása: • A kötések affinitásának összege • több ellenanyag affinitásának összessége • Az ellenanyag valenciája: • egy ellenanyaghoz kapcsolódó univalensligandumok száma • (monovalens, bivalens, pentavalens) valencia aviditás Abbas, Immunology, 7thedition

12. Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyag (készítmények)* http://absoluteantibody.com/antibody-resources/antibody-overview/antibodies-as-tools/ Egy antigénen általában több, a B-sejtek számára felismerhető antigén determináns (epitóp) található *sok db ellenanyag mindig

13. Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyagok

14. Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyagok immunizálás Egyedi B-sejtek izolálása és in vitro monoklonális (=egyetlen B-sejt klón terméke) ellenanyag termeltetése Poliklonális(=többféle B-sejt klón terméke) ellenanyagok Egy antigén több epitópjára specifikus ellenanyagok keveréke Egy antigén egy epitópjára specifikus ellenanyag

15. Hogyan állítjuk elő a gyakorlatban az ellenanyagokat? ANTIGÉN aktiváció osztódás differenciáció felismerés szekretált ellenanyag sIg B plazmasejt IMMUNIZÁLÁS (oltás) * -az adott antigén és az immunizálandó egyed viszonya (filogenetikai távolság) -az antigén kémiai természete -az antigén biológiai sajátságai (mennyire immunogén?) -az antigén bejuttatásának helye -az antigén mennyisége (alacsony és magas dózis tolerancia) -az antigén bejuttatásának módja (oltás, orális, kontakt szenzibilizálás, bőrátültetés) * sIg vagy mIg = surface vagy membrane Ig, ez maga a B-sejt receptor

16. Az immunizálás hatásfokának növelése ADJUVÁNSOK  antigén depót képeznek (lassítják az antigén felszívódását)  gyulladást idéznek elő az antigén behatolás helyén (veszély szignál a szervezet számára) Leggyakoribb típusok: Freund-adjuváns (+ /- Mycobacterium tuberculosis)IgG2a) aluminium-hidroxid (+/- Bordetella pertussis)IgG1) Nippostrongylus brasiliensisIgE; Salmonella typhimuriumIgA) szaponin ISCOM (immun stimuláló komplex) TiterMax, RAS (Ribi Adjuvant System)

17. Az immunizálás menete Emlékeztető: Elsődleges és memória válasz A specifikus ellenanyagok szintjének emelkedése  gyorsabb Izotípus megoszlás IgM  IgG/A/E Specifikus ellenanyag mennyiség  magasabb A specifikus ellenanyagok átlag affinitása  magasabb Ráoltás/Újraoltás/ Booster oltásugyanazzal az antigénnel oltunk(általában többször, oltási sémák) Sikeresség ellenőrzése vérvétellel

18. Poliklonális ellenanyagok előállítása • Főleg rágcsálókból (patkány, egér, nyúl, hörcsög)és kecskéből, marhából, lóbólMenete • Adott antigén tiszta formában történő előállítása • Ezzel immunizáljuk az állatot • vérvétel (sok) → szérumból (ezt immunszérumnak nevezzük) ellenanyagok kitisztítása • felhasználás

19. Poliklonális ellenanyagok előállítása Nagy mennyiségű vérvétel („immunszérum”, benne a specifikus ellenanyagok), és további tisztítás/felhasználás immunizálások Idő (napok) 0 21 42 Oltás sikerességének (=termelődött specifikus ellenanyag mennyiségének) ellenőrzése vérből

20. Az immunizálás menete (monoklonális) Lépsejtek (nem szérum!) izolálása, fúzió, stb immunizálások Idő (napok) 0 21 42 Oltás sikerességének (=termelődött specifikus ellenanyag mennyiségének) ellenőrzése vérből

21. Monoklonális ellenanyagok előállítása • relatív hosszú idő (2 hónap + tesztelés) • felszerelés igényes (steril sejtes munka) Lépések: Immunizálás az antigénnel Lépből B-sejtek izolálása B-sejtek hibridizációja mielómasejtekkel (immortalizáció) A sikeresen fúzionált sejtek szelektálása A megfelelő ellenanyagot termelő klónok szelekciója, felszaporítása, fagyasztása (hosszú távú tárolás)

22. Monoklonális ellenanyagok előállítása Immunizálás → megfelelő faj kiválasztása fontos, legtöbbször egér. A cél határozza meg (pl. egér fehérje ellen patkány, humán fehérje ellen egér, stb...) Lép izolálása, ebből B-sejtek tisztítása Hibridizáció = B-sejtek + mielómasejtek + PEGB-sejtek: primer sejtek az állatból, képesek alternatív úton DNS-t szintetizálni , korlátozott életképességűek, de tudnak ellenanyagot termelnimielomasejtek: B-sejt eredetű tumorsejt vonalak, nem képesek ellenanyagot termelni, nem képesek alternatív úton DNS-t szintetizálni, de korlátlan életképességűekLegtöbbször használt: Sp2PEG: polietilén glikol, vízelvonó szer Sp2 fúzió + PEG Ezeket az Sp2-B-sejt fúzióból létrejötthibridómákat kell szelektálni B-sejtek

23. Monoklonális ellenanyagok előállítása 4. A hibridómák szelekciója: HAT szelekciós médiumbanH – hipoxantin: az alternativ DNS szintézis út szubsztrátja A – aminopterin: a klasszikus DNS szintézis út gátlószere T – timidin: az alternatív DNS szintézis út szubsztrátja Mielóma(Sp2) B-sejt Hibridóma

24. Monoklonális ellenanyagok előállítása 5. A megfelelő ellenanyagot termelő hibridómák „klónozása” (=egy sejtből eredő klonális tenyészet készítése, ahol minden sejt egyforma) A HAT szelekciót túlélt sejteket nagyon nagy hígitásban (hogy kevés sejt kerüljön egy lyukba) szétosztjuk mikorkultúrákba Kiválasztjuk azokat a kultúrákat, melyek termelik az adott antigénre specifikus ellenanyagot (ez még oligoklonális!), és szétosztjuk úgy, hogy 1-1 klón jusson egy lyukba Újra teszteljük, hogy mely lyukakban vannak pozitív (a megfelelő specificitású ellenanyagot termelő) sejtek

25. Monoklonális ellenanyagok előállítása A pozitív klónokat felszaporítjuk Fagyasztva (folyékony nitrogén) tárolás Ellenanyag tisztítása a sejttenyészet felülúszójából Klón beoltása egér (azonos MHC hátterű/nude/scid) hasüregébe → nagy mennyiségű ellenanyag termelése aszciteszbe

26. Monoklonális és poliklonális ellenanyagok poliklonális ellenanyagok monoklonális ellenanyagok specificitás heterogén homogén affinitás heterogén homogén izotípus heterogén homogén keresztreakciók gyakori nincs előállítás olcsó, egyszerű drága, speciális felszerelést igényel immunizálás tisztított antigénnel szennyeződés nem zavar mennyisége korlátozott korlátlan jellemzés specificitás/keresztreagáló képesség – izotípus összetétel – átlag affinitás finom specificitás – izotípus – affinitás ajánlott módszerek elsősorban az Ag-EA kötődést követő másodlagos reakciók kimutatásán alapuló precipitáció – agglutináció – komplement aktiválás kis különbségek megkülönböztetésére alkalmas, jelöléses  FACS / MACS – blot - ELISA/RIA George Köhler és Cesar Milstein 1984

27. Monoklonális és poliklonális ellenanyagok ag ag

28. Ellenanyagok tisztítása Biokémiai tisztítási módszerekAz immunglobulinok fiziko-kémiai (töltés, mólsúly) tulajdonságai alapján szeparálunkA választott szeparálási mód és anyag attól függ, hogy milyen tulajdonságú ellenanyagot (pl. IgM vagy IgG) milyen egyéb fehérjéktől szeretnénk elválasztani • kisózás (pl. Na-szulfát, ammónium szulfát) • ioncserélő kromatográfia (pl. DEAE és CM cellulóz oszlopok) • gélszűrés (pl. Sephadex, Sepharose)

29. Ellenanyagok tisztítása

30. Ellenanyagok tisztítása 2. Affinitás kromatográfia A: Az ellenanyag konstans részén keresztüli tisztítás Protein G → IgG nehéz láncProtein A → IgG nehéz láncProtein L → κ könnyű láncJacalin → IgAMBL → IgMAlosztályokra, fajokra eltérő lehet a kötődés erőssége

31. Affinitás kromatográfia a konstans részen keresztül Elúciós oldat ami megbontja az ellenanyag és a Protein G közti másodlagos kötőerőket(általában pH változtatással) Fehérjekeverék(pl. immunszérum) Protein G Sepharose gyöngyökön(IgG hozzákötődik) Minden átfolyik ami nem képes Portein G-hez kapcsolódni (azaz nem IgG)

32. Affinitás kromatográfia az antigén felismerő részen keresztül B: Az ellenanyag felismerő részén keresztüli tisztítás A megfelelő specificitású ellenanyagok elválaszthatóak nemcsak a többi fehérjétől, hanem a nagyon hasonló, de más specificitású ellenanyagoktól is Elúció ugyanúgy mint Protein G-nél Fehérjekeverék(pl. immunszérum) Protein G-s tisztítás Sepahrose gyöngyökre kapcsoltantigén (=antigén szorbens) Megjegyzés: Ez a módszer antigén tisztítására is jó, csak ekkor az ellenanyagot kell a gyöngyökhöz kapcsolni, majd ezen átfolyatni az antigént is tartalmazó fehérje keveréket

33. Ellenanyagok tisztítása - összefoglalás Biokémiai módszerek, affinitás kromatográfia antigén • kisózás  globulinok (minden Ig izotípus, antigén specifitástól függetlenül) • ioncserélő kromatográfia  IgG (minden IgG alosztály, antigén specifitástól függetlenül) • Protein A / G / (L)  IgG (κ) (IgG alosztály különbségek, ill. a κ könnyűláncú ellenanyagok antigén specifitástól függetlenül ) • antigén szorbens  antigén specifikus ellenanyagok, Ig izotípustól függetlenül immunszérum(poliklonális) lépsejtek kivételemonoklonális készítés Sejttenyészet felülúszó(monoklonális) • Protein A / G / (L)  tiszta monoklonális ellenanyag • antigén szorbens  antigén specifikus ellenanyagok, • Ig izotípustól függetlenül (ha pl. Olyan izotípusú a monoklonálisunk ami nem kötődik Protein G/A/L-hez Hibridóma beoltása hasüregbe a nagyobb ellenanyag hozamért • kisózás  globulinok (főleg a monklonális Ig, de az állat „saját” ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) • ioncserélő kromatográfia  IgG (főleg a monklonális Ig, de az állat „saját” ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) • Protein A / G / (L)  IgG (κ) (főleg a monklonális Ig, de az állat „saját” ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) • antigén szorbens  antigén specifikus monoklonális, Ig izotípustól függetlenül hibridóma aszciteszfolyadék

34. Ellenanyagok módosítása Mit és miért lehet érdemes megváltoztatni egy ellenanyagon? • specificitás és affinitás • valencia • méret • effektor funkciók • könnyű konjugálhatóság (gyógyszerek, festékek, enzimek, stb.) • in vivo immunogenitás • a lebomlás sebessége • Ellenanyag terápiák (vakcináció, tumorterápia, gyógyszer irányítás) • faj idegen fehérje (pl. Egér monoklonális ellenanyag) → immunválasz → ennek elkerülésére ellenanyag módosítás (humanizálás, stb...) • az ellenanyag specificitása jó, de módosítani kívánjuk az effektor funckiót (komplement aktiváció, FcR kötés, stb..)

35. Ellenanyagok módosítása • Kémiai módosítás• Részleges redukció láncok közötti diszulfid hidak megszűnnek, szabad SH csoportok jönnek létre• Limitált proteolízis papain, pepszin• Konjugálás (JELÖLÉS) Az ellenanyagot vagy a létrehozott fragmentumokat összekapcsoljuk más molekulákkal • Molekuláris biológiai módosításjövő óra.... http://www.genovis.com/ms-analysis-of-mabs

36. Ellenanyagok fragmentálása IgG IgG F(ab’)2pFc’ 2x FabFc • Fajtól, izotípustól, glikoziláltságtól függ az emészthetőség (van, amit nem lehet) • Az emésztett termékeket a már ismert kromatográfiás módszerekkel lehet elválastztani egymástól • leggyakoribb enzimek: pepszin, papain • egyéb enzimek: tripszin, plazmin

37. Ellenanyagok tisztítása A termékek ellenőrzése SDS-PAGE-val